拟南芥T-DNA插入突变体鉴定实验报告.doc

拟南芥T-DNA插入突变体鉴定 实验报告 实验时间：2011.5.24-5.31 【摘要】 [目的]了解拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的基本原理，掌握提取植物基因组DNA的方法，PCR，以及用琼脂糖凝胶分离核酸的方法。[方法] 首先提取拟南芥基因组DNA，PCR扩增目的片段，最后分析电泳结果筛选出纯合突变体。[结果与结论]由电泳结果可观察到在1000-1500bp间和800-900bp间分别有条带，说明此拟南芥为杂合突变体植株。 【引言】 随着基因组计划的完成，人们对基因结构有了更深入的了解，而对基因功能的研究也成为热点。人们通过反向遗传学的手段，利用T-DNA插入突变技术，获得目的基因敲出突变体，再通过筛选出的纯合突变体，从而研究目的基因的功能，这是基因功能研究的主要方法之一。 反向遗传学研究的首要条件是获得基因敲出突变体，建立可靠、有效、方便的T-DNA插入突变体的鉴定方法。其中，三引物法是主要鉴定方法之一。 本实验首先要提取植物基因组DNA。其基本原理是先用液氮研磨植物组织破坏细胞壁，然后用CTAB裂解细胞膜使蛋白质变性，从而释放DNA。 对提取出的DNA进行PCR。聚合酶链反应即PCR是体外核酸扩增技术操作简便，能快速准确的将DNA片段扩增至十万乃至百万倍使肉眼能直接观察和判断。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。DNA变性（90℃-96℃）即双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA；退火（25℃-65℃）即系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链；延伸（68℃-75℃）即在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。循环35次。PCR的标准反应体系应包含： DNA模板、引物、反应缓冲液、dNTP、ddH2O、耐热聚合酶。 三引物法即采用三个引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约1107bp（LP+RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，所以也只能得到1种PCR产物，分子量约560-860bp （LBa1+RP）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到1107 bp和560-860 bp两种产物。电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。 此法优点是可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。本方法操作简单，成功率高，结果可靠，适用于从大量拟南芥T—DNA插入突变体中快速鉴定出突变体。 最后对PCR产物电泳。琼脂糖凝胶电泳技术的原理是，由于DNA含有PO43-基团而在pH8.0 Buffer中带负电，因此在电场中向正极移动，通过选用适当浓度的琼脂糖凝胶发挥的分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异从而达到分离目的。DNA经EB染色，EB可与核酸形成络合物，在紫外光激发下产生桔黄色荧光。  【实验用品】 1.拟南芥基因组DNA的提取 [材料] 拟南芥(Arabidopsis thaliana) T-DNA插入突变系植株 [试剂] 液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇或异丙醇，70%乙醇，TE ，等[器具] 离心管，水浴锅，离心机，吸管，移液枪，等 2.PCR [材料] 拟南芥基因组DNA [试剂] 10xTaq buffer，MgCl2，引物LP、RP、BP，dNTP, Taq酶，等[器具] 离心管，移液枪，PCR仪，等 3.琼脂糖凝胶电泳 [材料] 拟南芥DNA PCR产物 [试剂]tris硼酸EDTA，琼脂糖，上样缓冲液，Marker，EB，等[器具] 离心管，锥形瓶，移液枪，配胶板，电泳槽，等 【实验方法】 1.拟南芥基因组DNA的提取 （1）每个1.5 ml离心管放入3片左右拟南芥幼嫩叶片，用液氮将其研磨成细粉，加入预热至65℃的600 μl 的2×CTAB提取液，轻摇混匀。 （2）65℃水浴30 min，其间轻摇混匀。 （3）向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清入新管。 （4）向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20 ℃ 下30 min ，12000 rpm离心15 min，弃上清液。 （5）用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm离心5min，弃上清液。 （6）将沉淀晾干，加20-50 μl TE (pH 8.0)， 65℃水浴30 min溶解DNA。 2.PCR （1）在离心管加入试剂形成如下20ul反应体系： H2O 11.8ul 10xTaq b