琼脂糖凝胶电泳法教材.ppt

▲微量移液器的使用 规格 100—1000 μL ---蓝色吸头 20—200 μL-----黄色吸头 10—100 μL-----黄色吸头 0.5—10 μL----- 白色吸头 0.1—2.5 μL----- 白色吸头 ▲微量移液器的使用 简单结构 卸枪头按钮 握移液器手法 一、标准操作 适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液。 1)按到第一档，进入液面几毫米。 2)缓慢松开控制按钮，否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸入移液器内部吸入体积减少。 3)打出液体时贴壁并有一定角度，先按到第一档，稍微停顿1s后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。 ▲微量移液器的使用 二、注意事项 1)吸液时： 应进入液面，慢吸慢放；若移液器倾斜，则移液不准确。 2)装配吸头时： 应用力适当，选择匹配的吸头；若用力过猛，则吸头难以脱卸。 3) 应选择合适量程范围的移液器；切忌用大量程的移液器移取小体积样品。 4) 切忌直接按到第二档吸液。 5) 使用完后，应将移液器挂在移液器架上。 6) 移液器吸头都已灭菌，吸液体时不碰任何其他东西，避免交叉污染。 ▲微量移液器的使用 移液器使用视频 琼脂糖凝胶电泳法  —分离鉴定核酸的常规方法 用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。 琼脂糖（Agarose，AG）是琼脂中不带电荷的中性组成成份（几乎不含硫酸根，主要成分为多糖），其水溶液可以制成凝胶，具有多孔网状结构。 DNA分子在电场中移动方向： 等电点等于pH2~2.5，在常规电泳缓冲液（pH8.5）中，带负电荷，在电场中向正极移动。 核酸分子在琼脂糖凝胶中的迁移率（5个因素）： （1） DNA的分子大小： 分子越大，迁移越慢 （2） DNA分子的构象： 超螺旋环状＞线状DNA＞切口环状 （3）琼脂糖浓度： 浓度越大，凝胶越硬；较高浓度的凝胶有利于较小DNA片段的分离；较低浓度的凝胶有利于较大DNA片段的分离。 琼脂糖凝胶的 百分浓度（%） 线状DNA分子的 有效范围（Kb） 0.3 60～5 0.6 20～1 0.7 10～0.8 0.9 7～0.5 1.2 6～0.4 1.5 4～0.2 2.0 3～0.1 线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系 （4）电源电压： 低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比； 高电压时，随着电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。 ＞2 kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5 V/cm～8 V/cm。 （5）离子强度影响 在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动； 在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 结果观察： 制备凝胶时先加入少量荧光染料，其分子可插入DNA的碱基之间，可在紫外灯下直接观察到DNA片段在凝胶上的位置（荧光条带），也可在经凝胶成像系统中直接拍照。 器材 电泳仪、水平电泳槽、梳子、微波炉、紫外灯 试剂 琼脂糖、1X TAE电泳缓冲液 、6x Loading buffer、荧光染料 琼脂糖凝胶制备及电泳过程 琼脂糖凝胶制备及电泳 1、凝胶准备（0.8%）:用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。 ① 称0.8 g琼脂糖置三角瓶中，加100 mL 1×TAE ② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖 ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃，加入荧光染料 2μL，并轻轻混匀。 2、倒胶： ① 将冷却60℃的凝胶缓慢倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子。 ②室温下静置20 min，凝胶凝固。 ③拨出梳子，将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极。 3、点样： ①向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，让液面高于胶面1mm。 ② 样品准备：吸取5 μL已提取的基因组DNA点在点样纸上，加入1 μL 6×上样缓冲液，用移液器轻轻混匀。 ③上样：用移液器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。 上样缓冲液（loading buffer）：可显示两条带，前面蓝色是溴酚蓝，代表300bp左右；后面浅绿是二甲苯青，代表约4000bp左右。 功能：指示剂；沉降作用（含甘油），防止漂样。 4、电泳： ①盖上电泳槽，接通电源，开始电泳 。 电泳条件：电压80v（恒压）；时间30 m