琼脂糖凝胶电泳检测DNA教材.ppt

琼脂糖凝胶电泳的工作原理及操作 天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。琼脂糖是从海藻中提出的一种线性高聚物。它的分子结构分为一下两种。 琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。 D-半乳糖 3，6-脱水-L-半乳糖 二原理 琼脂糖是一种长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动 带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法 影响泳动率的因素包括样品的物理性状、支持物介质、电场强度和缓冲液离子强度 琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子 可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系 琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分离范围参数 凝胶浓度（%）线性DNA长度（bp） 0.5 1000～30000 0.7 800～12000 1.0 500～10000 1.2 400～7000 1.5 200～3000 2.0 50～2000 三、仪器、材料与试剂 微波炉 琼脂糖凝胶电泳系统 凝胶成像系统 DNA样品 DNA marker 50×TBE 10×凝胶加样缓冲液 琼脂糖 1％溴化乙锭溶液（EB） 溶解琼脂糖 分离DNA片段 检测DNA片段 电泳样品 DNA相对分子质量标准物 电泳缓冲液 沉淀DNA并起指示作用 电泳支持介质 嵌入DNA中，在紫外灯下显色 EB：即溴化乙锭，它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng 的DNA 注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套 四、实验步骤 一 琼脂糖的配制 1.配制0.8%的琼脂糖溶液：称量0.4g 琼脂糖倒入三角瓶中，加入50ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。 2.在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解（3次）琼脂糖。 3.冷却到60℃，加入2μl的1％ EB，并摇匀，凝胶呈微红色即可。(EB剧毒！操作时要戴上手套，）则为所需琼脂糖凝胶液 二 制作胶板 1.用溶解的琼脂糖将制胶板两端封好，（注意不可有缝隙。）插入适当梳子（注意调整梳子的高度，我个人的经验是在托盘底面放一块厚0.5-1mm的薄片，将梳子垂直插入，然后取走薄片。）。 2.将溶解的琼脂糖（约50℃）缓缓倒入，室温冷却凝固（凝胶适宜厚度为3-5mm，倒胶时一定要注意，不要让胶中留有气泡。） 3.在室温下放置30-45min让胶凝固，小心拔出梳子，（垂直拔出，避免破坏点样孔。）拔出托盘开放边卡板，（切记！否则不导电），将胶和推盘放置在电泳槽内。 4.向电泳槽中加入0.5×TBE，缓冲液高出胶面3-5mm即可。 5.用移液器吸取DNA样品2ul于塑料板上，再加入3μl 的上样缓冲液(BUFFER)，用微量移液器吹打，混匀后，小心加入点样孔 6.加marker5ul置中间或一侧点样空。 三 通电跑胶 1.打开电源开关，按照电源两极间距离5V/cm调节电压（本实验用电压100V），可见溴酚蓝条带由负极向正极移动，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳。 2.小心从电泳槽中取出凝胶，将凝胶在紫外投射分析仪中观察结果。（DNA存在处显出桔红色荧光条带）。 紫外透射分析仪 打开后 如图。 打开可见光调节 胶像的位置。 关闭可见光灯， 然后打开紫外灯 312nm。