生物制片显微绘图染色体和核型分析技术.ppt

生物实验技术 2010级硕士研究生 第一章 生物制片技术 石蜡制片法 一、石蜡制片法 石蜡制片法是生物学的基本实验技术之一。要完整的观察植（动）物的内部构造，必须先将实验样品制成显微标本片，许多植物药材用徒手切片或滑动切片法往往不易得到较薄且均匀的切片，因此，常采用石蜡切片法。 原理：将液体石蜡渗透到样品材料内部，待石蜡凝固成固体，再进行切片，所得切片薄而均匀，约厚4~5μm。有利于切片的长期保存和常规检查。 实验仪器、材料与试剂 实验仪器：石蜡切片机、切片刀、小木块（2.5×2×1.5cm）、解剖针、刀片、毛笔、酒精灯、培养箱、显微镜等。 实验材料：徐长卿根等 实验试剂：F.A.A.固定液、酒精、二甲苯、石蜡、甘油蛋白、番红染色剂、固绿（亮绿）染色剂等 实验步骤 取材 实验关键 1、取材：取材要有代表性，注意取材的时间、部位和方向。 2、固定：F.A.A.固定液（F=福尔马林：40%甲醛5ml；A=乙醇50%或70%90ml；A=冰醋酸5ml），固定时间：10~24h以上。 3、脱水（上行）：将材料用梯度乙醇（30%、40%、50%（可过夜）、60%、70%（可过夜）、80%、90%、100%）脱水至100%乙醇的过程。 4、透明：二甲苯（50%etoh+50%px、70%、100%、100%）透明至完全透明。 5、浸蜡：将液体石蜡（熔点：52~55℃）逐级浸入细胞中。 6、包埋：使处理后的材料包埋于石蜡中，待冷却后便于固定于切片机上，进行切片。 7、切片：修整切片，固定蜡块于切片机上，进行切片。 8、粘片：用蛋白黏合剂将蜡片粘在载玻片上。 9、脱蜡：用二甲苯将蜡片中的蜡溶解脱去。 10、染色（下行） ：用梯度乙醇将溶液逐步过度到染色剂的浓度。 （ 100% 95% 染亮绿试剂 80% 、70%、 60% 、 50%（可过夜）、 40%、 30% 染番红色 ） 11、脱水透明（上行）：用梯度乙醇将溶液逐步过度到无水状态。 （30%、40%、50%（可过夜）、60%、70%（可过夜）、80%、90%、100%、50%ETOH+50%PX、100%PX） 12、封片：树脂封片 二、冰冻制片法 冰冻切片 是借助低温冷冻将活体组织或新鲜组织快速冻结达到一定的硬度进行制片的一种方法。可省去包埋过程中的一切繁杂手续和时间能够得到迅速的切片和显微鉴定结果。如手术中等待冰冻快速病理报告，以病变性质而决定手术方式和范围。 操作步骤： 冰冻切片的优缺点： （一）优点： 1．简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。 2．快速，用时短。 3．组织变化不大。 4．能很好保存脂肪，类脂等成分。 5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。 （二）缺点： 1．不容易做连续切片。 2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。 3．不容易制作较薄的切片。 4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。 冰冻切片机的使用及注意事项 （1）新鲜的组织制备 组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（－78℃） ② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（－80℃） ③ 液氮（－190℃）④ 液氮冷却的丙烷（－19℃）。液氮适用于组织化学，较安全。缺点：组织块易发生龟裂。 （2）固定组织的制备 为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。 （3）恒冷箱温度 一般在冷冻后10分钟，到接近冷室温度时再切，一般组织在－15～－20℃切片最易成功。每种组织有其合适的切片温度、刀的温度和冷室温度。应根据经验总结。 （4）抗卷板 抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离，使切片平滑通过。抗卷板略高于刀面的最高点。可凭经验调整刀对组织的角度，一般新刀为20゜。 （5）切片机 操作程序：先接通电源，调定恒冷箱温度，调整切片刀的角度，调定切片厚度，标本置载台致冷达所需温度后，将其安放在切片机推进器上。即可切片。 恒冷箱视使用情况每周或每月清洁一次冰霜。 （6）切片刀 新刀切片满意，旧刀用自动磨刀机磨刀较好。如果切片刀与抗卷板的位置，角度合乎要求，又有一把锐利的刀，就能获得理想的切片。 三、滑动切片法 滑走切片法（永久制片） （1）水浸软化材料（如为鲜材料或固定材料不用软化） （2）分割材料成适当大小。 （3）如为木质材料用甘油再软化