染色体与DNA.教材.ppt

DNA的变性与复性 本节学习重点 DNA变性曲线，包括增色效应、减色效应、 Tm及其影响因素 DNA复性曲线，包括影响复性的诸多因素和 C0t(1/2) 一、DNA分子的变性 1、变性（denaturation 或 融解 melting）： DNA双螺旋区的氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变成单链，这一链分离的过程叫做变性。 条件：加热，高pH，有机溶剂（ 尿素、 酰胺 )，低盐浓度等 ※ 熔液黏度降低 ※ 沉降速度加大 ※ 浮力密度上升 ※ 此外吸收值升高（A260nm），即增色效应 指在DNA变性的过程中，它在260nm的吸收值先是缓慢 上升，达到某一温度时及骤然上升。 单一核苷酸的光吸收值最大，其实是单链DNA 或RNA，双链DNA最小，这是由于碱基在疏水环境中的堆积所造成的。即双链DNA相对于单链DNA是减色的（hypochromic），反之单链DNA 相对于双链DNA 是增色的（hyperchromic）。 1.185 1.0 1.37 OD ℃ Tm = ℃ of Ct = C0/2 = OD增加值的中点温度 或DNA双螺旋结构失去一半时的温度 Tm是DNA的（G+C）含量的函数。 熔解曲线与Tm值 核酸在260nm处的光吸收可用于测定其浓度。当浓度为1mg/ml、光程为1cm时，双链DNA 的A260=20，RNA和单链DNA的A260=25。 OD260/OD280可用于测定DNA纯度。 OD260/OD280 =1.8为纯dsDNA， 纯RNA为2.0，蛋白小于1（一般是0.5）。 2、 常用的变性方法 ☆ 热变性 ☆ 碱变性 应用广泛，特别是用于变性动力学研究 缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链 pH＝11.3时，全部氢键被淘汰 无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法 ◎ 保存单链DNA的条件 保持pH大于11.3 盐浓度低于0.01mol/L D.S DNA S.S DNA Denaturation ▲ ▼ Renaturation 复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 二、DNA分子的复性 （anneal or renaturation） 概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以 重新地合成双螺旋结构的过程（退火） ?复性DNA分子不一定是原有的一对互补链 1、 影响DNA复性过程的因素 ： ? 阳离子浓度 0.18 ~ 0.2M Na+ 可消除静电斥力 复性反应的温度 低于Tm值 25℃左右 (60-65℃) ? S.S. DNA 的初始浓度 C0 ?DNA分子中，碱基排列情况（重复序列、单一序列） ? S.S. DNA分子的长度（片段的大小） S.S. DNA愈长 S.S. DNA愈短 → 分子扩散愈慢 → 复性愈慢 → 分子扩散愈快 → 复性愈快 3’-ATCTATGCTGTCAT-5’ 5‘-TAGATACGACAGTA-3’ 5‘-TAGATACGACAGTA-3’ 3’-ATCTATGCTGTCAT-5’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’ 5‘-TATATATATATA-3’ 3’-ATATATATATAT-5’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’ 二、C0t曲线－－复性动力学曲线 ? 遵循二级反应动力学 dCt / dt = -KC02 反应初始 t = 0 ? 单链DNA的随机碰撞 过程（ randomly collision ） 单链 DNA浓度 = C0 反应达 t 时 单链DNA浓度 = Ct K＝复性速度常数 dCt / dt = -KC02 积分 Ct / C0 = 1 / (1+KC0t ) 当 Ct / C0 = 1/2 时 Ct / C0 = 1/2 = 1 / (1+ KC0t(1/2)) K = 1 / Cot(1/2) Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) Ct/C0是C0t的函数 按此公式作图得C0t曲线 C0t(1/2)值对DNA