人工合成多聚核苷酸体外翻译技术教材.pptVIP

第六章 蛋白质的生物合成 蛋白质生物合成又称翻译（translation），是指由RNA参与的蛋白质生物合成的过程，它将核酸的碱基序列转变为蛋白质中的氨基酸序列。 参与翻译的RNA分子有tRNA、rRNA和mRNA。tRNA的功能是转运氨基酸，rRNA与多种蛋白质组成核糖体作为翻译进行的场所，mRNA作为翻译的模板。 经过三种RNA以及多种蛋白质的相互作用，使来自DNA的遗传信息正确地传递到蛋白质。 第一节 遗传密码 一、遗传密码 遗传密码（genetic code）是联系核酸的碱基序列和蛋白质的氨基酸序列的途径。mRNA上由三个碱基代表一种氨基酸，称为密码子（codon）。 生物体内存在多个密码子代表一种氨基酸的情况。 1954年，物理学家George Gamov根据在DNA中存在四种核苷酸，在蛋白质中存在二十种氨基酸的对应关系 ，提出三个核苷酸为一个氨基酸编码是最理想的。因为在有四种核苷酸的条件下，64 （43=64）是能满足为20种氨基酸编码的最小数，这也符合生物体在亿万年进化过程中形成的和遵循的经济原则 。 密码子的破译是分子生物学发展史上的一件大事。主要运用了两项技术，一项是1961年由Nirenberg等报道的人工合成多聚核苷酸体外翻译技术；另一项是1964年Nirenberg和Leder发明的核糖体结合技术。 这两项技术的出现，为密码子的破译奠定了基础。 破译密码的实验研究先后由三个实验室逐步发展了四种破译方法，于1965年完成。 1) 在体外无细胞蛋白质合成体系中加入人工合成的polyＵ开创了破译遗传密码的先河。1961年，美国NIH的Nirenberg和Mathaei第一次确认了UUU是Phe的密码子 。随后他们又确定了AAA是Lys的密码子，CCC是Pro的密码子。 2) 混合共聚物(mixed copolymers)实验对密码子中碱基组成的测定 1963年，Speyer和Ochoa等发展了用两个碱基的共聚物破译密码的方法。例如以A和C原料，合成polyAC。但这个方法不能确定碱基的排列方式，而只能显示密码子中碱基组成及组成比例。另外，通过反复改变共聚物成份比例的方法亦十分麻烦和费时。 3) aa-tRNA与确定的三核苷酸序列(密码子)结合（核糖体结合技术） Nirenberg和Leder于1964年建立了破译密码子的新方法，即tRNA与确定密码子结合实验。即是在缺乏蛋白质合成所需的因子的条件下，特异氨基酸-tRNA(aa-tRNA)也能与核糖体-mRNA复合物结合。最重要的是这种结合并不一定需要长的mRNA分子 。但有一些三核苷酸序列与核糖体结合并不象UUU或GUU等那样有效 。 4) 用重复共聚物(repeating copolymers)破译密码 Jones，和Khorana等人应用有机化学和酶学技术，制备了已知的核苷酸重复序列。蛋白质在核糖体上的合成可以在这些有规律的共聚物的任一点开始，并把特异的氨基酸参入肽链。例如，重复序列CUCUCUCUCU......是多肽Leu-Ser-Leu-Ser......或者是多肽Ser-Leu-Ser......的信使分子 。 除甲硫氨酸和色氨酸外，其他的氨基酸均有两种以上的密码子。多种密码子编码一种氨基酸的现象称为简并（degeneracy），代表同一种氨基酸的密码子称为同义密码子（synonyms）。 氨基酸的密码子数目和它在蛋白质中出现的频率并没有明显的正相关性。 一种氨基酸的几个密码子的差异通常在第三个碱基，说明了密码子的第三个碱基具有一定的灵活性。 在所有的生物体内，密码子字典几乎是通用的，这已被体内和体外的翻译实验所证实。 线粒体的遗传密码子存在较多的例外情况，其中最常见的一种变化是UGA由终止密码子变为色氨酸的密码子，这可能是进化上最早期的变化。 二、密码子和反密码子的相互作用 密码子决定氨基酸是通过mRNA与tRNA相互作用实现的，这种作用实质上是碱基间的配对。 密码子与反密码子（anticodon）间的正确识别是遗传信息正确传递的保证。 一般来说，生物体内tRNA的种类要少于编码氨基酸的密码子。密码子的前两位碱基在和反密码子配对时遵循Watson-Crick原则，而第三位碱基则有一定的灵活性，这就是摆动假说（wobble hypothesis）。 在不同生物体内，存在多种方式使少数的tRNA识别61种编码氨基酸的密码子，不同的生物所采用的途径也不同。 tRNA分子中含有较多的修饰碱基。位于反密码子中的或其他位置的修饰碱基均会对密码子和反密码子的作用产生影响。 第二套密码系统的概念和特征 1988年，Christian deDuve在Hou和Schimmel等人的研究基础上，提出了第二套密码系统的