人参果茎尖脱毒培养.ppt

人参果( Solanum muricatum Ait )是近年来国内引进和推广种植的新型果蔬作物,其营养保健价值高于一般果蔬。人参果主要通过扦插繁殖,体内病毒感染严重,并逐代积累, 严重影响其生长发育以及产品的产量和质量。通过茎尖培养进行种苗脱毒和快速繁殖是生产无病毒种苗的有效途径。有关人参果组织培养方面的研究已有多篇报道,但脱毒培养方面的研究较少。本研究采用不同的处理方法进行茎尖脱毒培养, 以期为人参果脱毒苗的工厂化生产提供实验依据。 实验方法 无菌苗培养：选取生长健壮、无病虫的健康植株，外植体（茎尖、茎段） 在无菌条件下用75%酒精浸泡1 min，再用5%次氯酸钠溶液浸泡15 min，无菌水冲洗5～6 次，然后用无菌滤纸吸干，于解剖镜下剥取0.2 mm 茎尖，接种于附加白糖3%，琼脂0.7%，pH 值5.8 的基本培养基上初代培养。为降低污染，每个培养基均接种1个茎尖。 生长分化培养基筛选 以MS 培养基为基本培养基, 分别加入1.0 mg·L-1 6-BA 以及0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mg·L-1NAA, 以选出最适NAA浓度。之后以最适浓度NAA与0、1.0、2.0和3.0mg·L-1 6-BA 组合, 筛选出人参果生长分化的最佳激素配比。 在MS 培养基中, 添加不同浓度NAA, 促使顶芽快速伸长, 以利于茎尖的剥离和切取。NAA 实验浓度为0、0.05、0.10、0.50、1.00 和2.00 mg·L-1。 茎尖剥离、接种和培养 取伸长最快的试管苗茎尖,在XTX-2型体视显微镜下切取0.2mm 茎尖,接种于下列培养基上,比较其生长分化质量。A1: MS+0.1mg·L-1NAA+2.0mg·L-1 6-BA;A2:MS+0.2mg·L-1 NAA+2.0mg·L-1 6-BA;A3:MS+0.2mg·L-1NAA+4.0mg·L-1 6-BA;A4:MS+0.4mg·L-1NAA+4.0mg·L-16-BA。 壮苗快繁培养基筛选 在上述实验基础上,选用MS+0.5mg·L-1NAA培养基, 分别加入0、0.01、0.05、0.10、0.20和0.30mg·L-1PP333,筛选有利于壮苗快繁的最佳培养基。 病毒检测 在继代培养的试管苗中随机抽取5瓶,利用生物学和电子显微镜方法观察脱毒状况。生物学测定方法:将人参果组培苗取出冲洗干净后,研成汁液,分别接种,鉴别寄主10种,置隔离温室中观察症状反应。电子显微镜观察是将铺有福尔马膜的铜网,用直粘法制片,观察病毒的粒体形态。同时取未脱毒培养的植株做同样检测。实验由国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所进行。 结果和分析 不同浓度激素对人参果生长分化的影响 人参果植株营养生长较旺盛,产生不定芽和不定根的能力很强, 因此在外植体初代培养时选用不添加任何激素的MS培养基。结果表明,顶芽接种5~7d后,基部产生不定根,然后茎尖和叶原基开始生长和分化。1个月可长成3cm左右的植株,2个月长至瓶口,并具8~10个叶片。外植体接种30瓶,成活21瓶。以初代培养的瓶苗为材料,剪取单叶茎段接种培养,筛选最适生长分化培养基。结果表明,当6-BA 浓度为1mg·L-1时,较适的NAA浓度为0或0.2mg·L- 1;以上述NAA浓度进一步筛选, 得最佳激素组合为0.2mg·L-1NAA+0mg·L-16-BA或不添加任何激素, 在这2种培养基上芽和根的发生速度、长度和发生率均优于其他组合。 茎尖大小对存活率和分化的影响 植物脱毒苗组织培养的关键是茎尖的切取,只有顶端分生组织及其下部尚未分化维管组织的芽尖未受病毒感染,因此,芽尖切取应不超过0.2~0.3mm。茎尖愈大,愈易成活,但去病毒的概率降低;茎尖太小不易成活, 或只有愈伤组织的增殖,不易分化。本研究共接种48个茎尖,存活28个,成活率58%。其中有4 瓶生长较慢,只有愈伤组织的增殖,无芽的分化;另有3瓶茎尖切取过大(0.4mm),很快直接发芽、生根,并长成完整植株。 NAA对人参果茎尖伸长的作用 植物的茎尖被叶原基所包被,不易切取,因此,在取材之前通常用35℃的温度促使芽茎尖迅速伸长,然后再切取茎尖。本实验则根据适宜浓度的生长素类物质可促进细胞纵向快速伸长的理论,通过调节培养基中NAA浓度来选取有利于人参果茎尖快速伸长和剥离的培养基。实验结果见表1。 表1 培养基中不同浓度NAA 对人参果茎尖生长状况的影响 适宜浓度的NAA有利于茎尖的生长和不定根的产生,其中0.5