人体寄生虫分子生物学与免疫学研究进展教材.ppt

* * DNA断裂先形成50-300 kb的大片段，进而在核小体连接处断裂，形成180-200 bp或200 bp整倍数的DNA片段，这些DNA片段可从细胞中提取出来，通过琼脂糖凝胶电泳，染色呈现梯条带（DNA Ladder）,并据此判断细胞凋亡的产生。 * 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物 酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 七、寄生虫与细胞凋亡 定义： 细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(Programmedcell death, PCD),是不同于坏死(Necrosis)的另一种细胞死亡形式。它是由基因控制的、细胞自主的有序死亡。凋亡与组织器官的发育和机体正常生理活动的维持密切相关。在正常情况下,机体通过凋亡清除衰老或异常的细胞,并控制细胞的数量,调节组织器官的大小、形状,以维持正常的生理平衡。过度凋亡或正常凋亡的过程被抑制,均可导致组织或器官发生病理改变甚至死亡。自1972年Kerr等提出凋亡的概念后,细胞凋亡现象成为医学生物学各学科共同关注并极为活跃的研究领域。 寄生虫感染与宿主细胞凋亡 ★ 诱导细胞凋亡 某些寄生虫感染诱导宿主细胞凋亡在疾病的发生机制中起着重要的作用,如引起CD4+细胞的缺失（利什曼原虫、微小隐孢子虫、血吸虫、肝包虫、丝虫、蛔虫等）,诱导宿主的免疫功能低下等。 ★ 抑制细胞凋亡 刚地弓形虫感染的细胞能抵抗多种诱导剂引起的细胞凋亡,包括Fas依赖和非依赖的细胞介导的细胞毒性、IL-2缺乏、γ-射线、紫外线等诱导的凋亡,而这种抑制活性需要活的细胞内寄生虫和不间断的蛋白合成。杜氏利什曼原虫可抑制骨髓衍生的巨噬细胞凋亡,这有利于原虫在巨噬细胞内大量繁殖。 寄生虫的细胞凋亡 ★ 弓形虫： NO体外诱导速殖子凋亡 ★ 伯什疟原虫： 红内期虫体自发凋亡 ★ 血吸虫：NO，基因组中包含细胞凋亡的基因 ★ 肝包虫：H2O2诱导 ★ 锥虫：改变体外培养条件、虫体密度诱导凋亡 检测方法： ★ 普通光镜检查、荧光显微镜和透射电镜检查等形态学观察 ★ DNA琼脂糖凝胶电泳 ★ 检测DNA含量的PI染色法 ★ 末端转移酶标记技术 (TUNEL法) ★ 检测细胞凋亡中关键蛋白的表达活化水平 ★ 检测细胞膜成份变化的Annexin V联合PI染色法等多种流式细胞术定量分析方法 作业 细胞凋亡在寄生虫与寄生虫病研究中的意义。 目前MicroRNA在寄生虫研究中的主要内容。 * 我国在鸡球虫方面的研究领先 * 寄生虫基因组计划于1995开始实施,到目前为止,开展基因组计划的人体寄生虫主要有恶性疟原虫、利什曼原虫、锥虫、丝虫和血吸虫。 * 30MB；14条染色体；约5300gene；6年时间；基因组中80%的碱基为A和T；2008年另两种疟原虫——间日和三日；同年其中间宿主库蚊测序也完成 * 抗原（var）基因家族编码的恶性疟原虫红细胞膜蛋白1（PfEMP1）是发生抗原变异和介导细胞黏附的主要蛋白。Science 15 January 2010 青蒿测序完成，并找到了产生药物的特别基因和其标记物，意味着可大量生产青蒿素 * 枯氏锥虫——DNA复制和修复机器 、布氏锥虫——代谢的途径和一些细胞生物学 ，硕大利什曼原虫——不寻常的基因表达等问题；基因组都是单倍体，长度从25到55Mb大小不等；多数基因都以长且定向的聚集方式组合在一起，暗示主要是以多顺反子地形式进行转录，随后被切割成单独的mRNA分子。在三个基因组中很少发现表达转录因子的基因存在，但高表达一些含有RNA结合基序的蛋白质。这些观察结果支持了先前的观点，就是锥虫基因表达的调控主要发生在转录后水平。缺乏转录水平的精确调控带来了一个有趣的结果：只有通过基因的复制或扩增来增加表达水平的提高。从DNA复制和修复的角度来看，锥虫类和真核生物的其他生物区别很大。基因组不包含牵涉到应对氧胁迫的基因；复制起始装置更像古菌，而非真核生物（生物学和进化学上的兴趣 ）。锥虫类特异性蛋白激酶，类细菌的线粒体DNA聚合酶，以及特殊的表面蛋白修饰都可以作为潜在的药物靶位点。 ? * 06年我国蛋白质组学研究，EST标签，鉴定了多数基因 * 编码基因13469个,其中有首次发现的与血吸虫感染宿主密切相关的弹力蛋白酶基因。日本血吸虫一方面丢失了很多与营养代谢相关的基因,如脂肪酸、氨基酸、胆固醇和性激素合成基因等,这些营养物质必须从哺乳动物宿主获得;另一方面,扩充了许多有利于蛋白消化的酶类基因家族的成员。 与