普通免疫学-8-2014-单克隆抗体.ppt

STEP 6: 检测方法 样品1 样品2 电泳迁移率：在特定介质中单位电场强度的带电颗粒电泳移动速度。电泳迁移率与颗粒所带电荷量成正比，与颗粒的半径和介质黏度成反比。实际工作中常用相对电泳迁移率，即两种带电颗粒在同一介质、同一电场中泳动距离之比。 一般情况下电泳中蛋白质分子量对数与迁移率呈线性关系 。 免疫学的应用 1. 免疫监测 人绒毛膜促性腺激素（HCG）的免疫监测 尿液 胶乳 胎盘合体滋养层细胞产生大量的人绒毛膜促性 腺激素，可通过孕妇血液循环而排泄到尿中 人绒毛膜促性腺激素的免疫监测-阴性对照 2. 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)分离蛋白 Co-IP工作示意图 Co-immunoprecipitation binding wash elution Y Y Y Y Y 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)分离蛋白 Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes 抗体基因文库 将不同的重链和轻链基因随机组合，克隆到合适的表达载体（噬菌体）中，在原核细胞表达不同的抗体，形成一个抗体库。 从这个抗体库中， 用抗原可以筛选到相应的抗体基因。 优点： 一是从不适合进行人工免疫的物种获得单克隆抗体，如人源单克隆抗体；二是可快速方便获得亲和力高、特异性强的克隆抗体。 主要的抗原抗体反应 抗体效价的测定 血清：血液凝固析出的淡黄色透明液体 ，在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原。 抗体效价(滴度，titer)：通过血清学方法能显示一定反应的抗血清(或抗体)的最高稀释倍数(或稀释度的倒数)。如终点稀释度为1/100，则血清的效价(每1ml的血清中抗体效价)为100抗体单位的高低是衡量血清中抗体水平的一项检测指标。 试管凝集实验（tube agglutination test） 原理：大分子颗粒性抗原（细菌、红细胞）与其相应的抗体相结合，在适量的电解质存在及一定的温度下，经过一定的时间可出现肉眼可见的凝聚团块。一般以标准抗原测得免疫血清或患者血清中抗体的效价。 不加免疫血清 ＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋：凝聚强度 ＋：出现凝聚 －：无凝聚 抗体稀释度应根据： ①抗体效价高，溶液中特异性抗体浓度越高，工作稀释度越高；②一般讲，应用的抗体稀释度越大，温育时间越长。③抗体中非特异性蛋白含量、只有高稀释度时才能防止非特异性背景染色；抗体的稀释主要是指第一抗体，因为第一抗体中特异性抗体合适的尝试是关键,应用高稀释度第一抗体仅显示主亲和力的特异性染色反应,减少或消除其中交叉抗体反应。 三、常见免疫分析方法 利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行量和质的测定分析。这类分析方法具有特异、灵敏和快速的特点。 免疫沉淀 1. 环状沉淀实验：是溶液中的沉淀反应。在体外当抗体与相应抗原二者浓度比例恰当时，会发生免疫沉淀。 抗体与多价抗原结合的浓度带现象 2.免疫双扩散 抗原抗体在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。双扩散是在琼脂板中抗原和抗体分别从相邻的孔中向四周扩散，在抗原孔和抗体孔之间二者比例合适的部位形成沉淀线。 当两个抗原完全一致时，两条沉淀线完全融合；如果两个抗原无共同抗原决定簇时，沉淀线互不干扰；当两个抗原只是部分抗原决定簇相同，还有其他不同的抗原决定簇，则沉淀线在后者一方形成突出的小刺 3. 免疫电泳 利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同能被分离开来的特点与免疫扩散结合一起进行分析的方法。 1、 血清免疫电泳:双扩散 2、火箭电泳：为加速度的单向免疫扩散(抗原扩散,抗体不扩散)与电泳结合的一种方法 在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加入待测标本后，将抗原置阴极端，抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比，用标本中的抗原含量。 酶联免疫分析法 广泛使用,因酶促反应使测定的结果被放大,反应灵敏度高。 酶标方法 直接酶标 间接酶标 用于标记抗体的酶: 辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase) 化学发光剂: 荧光醇（luminol） 利用化学发光(chemiluminescent)检测抗原和抗体相互作用. 化学发光(chemiluminescent) 原理 化学发光剂如荧光醇（luminol