罗制多聚酶链式反应扩增DNA片段教材.ppt

【模型建构3－3】 　　　１、DNA平面结构的构建过程 5′ 3′ 细胞内,在DNA聚合酶的作用下,两条反向平行的脱氧核苷酸链的合成方向,只能是5′→ 3′ 　发现A-T与G-C碱基对，具有相同的形状和直经。这样组成的DNA分子具有稳定的直径。 　两条链的相应碱基在配对形成氢键时,A-T配对，G-C配对。 5′ 3′ A-T配对，形成２个氢键。 G-C配对，形成３个氢键。 Pi Ａ 1 2 3 4 5 … Pi Ｔ 1 2 3 4 5 Pi Ｇ 1 2 3 4 5 Pi Ｃ 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Pi Ｇ 1 2 3 4 5 Ｃ Pi Ａ 1 2 3 4 5 Pi 1 2 3 4 5 Ｔ Pi … 2种嘧啶 Ｃ Ｔ Ｇ Ａ 2种嘌呤 ①4种含氮碱基 ③磷酸 Pi ②脱氧核糖 1 2 3 4 5 2种嘌呤 Ｇ Ａ Ｃ Ｔ 2种嘧啶 Ｃ Ｔ Ｏ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ Ｈ Ｈ Ｈ Ｈ H OH OH CH2 HO— 1 2 3 4 5 脱氧核糖的结构式 简化 Ｏ CH2 HO— OH Ｈ Ｈ Ｈ Ｈ OH 1 2 3 4 5 H 简化 简化 磷酸 OH DNA的基本组成物质 * 专题五：浅尝现代生物技术 舞钢市一高 罗瑞锋 多聚酶链式反应扩增DNA片段 polymerase chain reaction（PCR） 【实验目的】 1.尝试PCR技术的基本操作 2.扩增的特异性DNA片段的琼脂糖凝胶电泳检测 3.知道体内DNA 复制和PCR 的区别和联系 碱基 碱基 碱基 碱基 碱基 碱基 碱基 碱基 3′端 5′端 5′端 5′端 3′端 碱基 碱基 碱基 碱基 碱基 碱基 碱基 碱基 碱基 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ 3′端 碱基 碱基 碱基 碱基 碱基 ③ ④ ⑤ 碱基 碱基 碱基 碱基 碱基 碱基 碱基 5′端 3′端 ① ② 碱基 碱基 碱基 碱基 DNA聚合酶只能催化，结合于模板链上的核苷酸单链的3′端结合一个脱氧核甘酸 回忆体内DNA复制过程 体内DNA分子的复制 条件：DNA模板 解旋酶、DNA聚合酶等 4种脱氧核苷三磷酸为原料 需要消耗能量 RNA引物 过程：边解旋边复制 子链合成方向：5′-3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ PCR—聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） 美国 卡里·穆利斯（Mullis） 1944年生于美国。 1988年发明了PCR技术 1993年获诺贝尔化学奖 PCR技术的发明 目的基因核苷酸序列已知或部分已知 1.PCR过程所需条件 模板：DNA片段（Y染色体SRY基因 ）2种引物：各自5′端序列相互补的DNA引物 （20个左右碱基的短DNA单链）DNA聚合酶：耐高温的TaqDNA聚合酶；原料：dNTP （4种脱氧核苷三磷酸：dATP、dTTP、 dGTP和dCTP） 【实验原理】 变性 延伸 退火 2.PCR技术的原理 热变性：双链DNA打开 引物与模板单链结合 DNA的聚合反应 5’ 3’ 5’ 3’ 变性 5’ 3’ 5’ 3’ 退火 延伸 5’ 3’ 5’ 3’ 20s 20s 20s 预变性 30s 保温 30s 一个循环约需2min； 50分钟可以扩增目的基因225个 延伸片断的长短由所设置的延伸时间而定,延伸时间的设置根据基因片断的大小而设定 3.电泳基本原理 　　琼脂糖凝胶电泳常用于DNA、RNA大片段的分离，核酸磷酸基团带负电荷可向阳极移动，在电场驱动力和凝胶阻力下产生不同迁移率。 　　电泳一般需要Marker（标记），为已知分子量的标准DNA片段，在电泳中作为未知样品大小的参照物。 　　如λDNA/EcoRⅠ的分子量为21.226; 7.421; 5.804; 5.643; 4.878; 3.530kb。 【实验器材和材料】 1．PCR仪 2．0.2mL 消毒离心管 3．2支移液器（量程为10μL） 4．男生3根带有明显毛囊的头发 5．人性别鉴定试剂盒（克隆Y染色体SRY基因） 6．琼脂糖凝胶电泳试剂盒 【实验流程】 保存于冰块中的聚合酶 1.仪器和用品的准备 ddH20 10Xbuffer+MgCl2 dNTP 引物Ⅰ和引物Ⅱ 2．PCR SRY 基因 ⑴取材： 每组1位男生拔取3根带有毛囊的头发，剪下带有白色毛囊（1mm）的部分，小心放入两面板上的0.2mL离心管中，用记号笔做好标记。 两面板 毛囊（模板DNA） ⑵配置PCR体系：