分子发光分析fa讲述.ppt

氧原子与CO的发光反应： CO + O → CO2* CO2 * → CO2 + h? 发射光谱范围：300～500 nm；灵敏度1 ng/mL； c. 乙烯与O3的发光反应 乙烯与O3反应，生成激发态乙醛： CH2O* → CH2O + h? 最大发射波长：435 nm；对O3的特效反应；线性响应范围1 ng/mL ～1 ?g/mL； 3. 液相化学发光 ——研究和应用的比较广泛的有鲁米诺（Luminol）光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。 鲁米诺是最常用的发光试剂，它可以测定Cl2、HOCl、OCl-、H2O2、O2和NO2，产生化学发光反应时量子效率为0.15~0.05 鲁米诺（3 –氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中和H2O2等氧化剂反应生成最大波长为425 nm的光辐射 氧化剂 425 nm 反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于激发状态，返回基态时发射荧光 可检测低至10-9 mol·L-1 的H2O2 鲁米诺H2O2的发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等 利用鲁米诺发光体系可以测定50余种元素和大量有机和无机化合物，灵敏度都比较高 鲁米诺化学发光体系还可用于许多生化反应研究，常常涉及到H2O2的产生或H2O2参加反应 氨基酸 + O2 ????? 酮酸 +NH3 + H2O2 氨基酸氧化酶 葡萄糖 + O2 + H2O ????? 葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。 葡萄糖氧化酶 生物发光分析应用 1 在pH 7～8；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)： ATP + LH2 + E + Mg2+ ????AMP· LH2 · E +Mg ppi + 2H+ pH 7 - 8 复合物与氧反应，产生化学发光： AMP· LH2 · E + O2 ???[氧化荧光素]* + AMP+CO2 + H2O [氧化荧光素]* ??? 氧化荧光素 + h? 最大发射波长562nm； 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。 生物发光分析应用 2 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应 ： NADH + FMA + H+ ?????? NAD+ + FMNH2 NADH脱氢酶 FMNH2 + RCHO + O2 ???? FMN + RCOOH + H2O + h? 黄素酶 最大发射波长495 nm； 1. 灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定2?10-17 mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量 2. 仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正； 3. 发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰； 4. 线性范围宽——一般有5~6个数量级 5. 分析速度快，易于实现自动化 缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；发光机理有待进一步研究。 装置流程： 发光反应室 光检测器 信号放大器 显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行： 静态方式：用注射器或移液管分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差； 流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度。 自动化程度高，分析速度快，适于批量试样测定 16世纪，人们发现了荧光现象； 1852年，Stokes对荧光发射机制作出了阐述； 1864年，Stokes提出可将荧光作为一种分析手段； 20世纪60年代，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析方法和技术得到了极大发展。 从T1 ? S1要改变电子自旋，发光速度慢，约为 10-4 ~ 10s，光照停止后，磷光仍可持续一段时间 分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长 ? 磷 ? 荧 ?激