高效的毛细管电泳法讲述.ppt

四.HPCE操作模式 HPCE各种方式 方式 分离依据 毛细管区带电泳 自由溶液的淌度 胶束电动色谱 与胶束间的疏水性/离 子性相互作用 毛细管凝胶电泳 大小和电荷 等电聚焦 等电点 等速电泳 移动界面 （一）毛细管区带电泳（特点）  Capillary zone electrophoresis 操作简单、多样化 应用广 溶质以不同的速率在分立的区带内迁移而分离 EOF存在 1.选择性和添加剂的使用 （1）缓冲液的选择 种类 pH 浓度 ①种类——选择缓冲溶液原则 较强缓冲能力； 低紫外吸收； 小淌度 ②缓冲溶液的pH pH改变 改变溶质所带电荷（pH低于 pI，pH 高于 pI） 伴随EOF变化 导致选择性差异 HPLC收集到的多肽在CZE中的流出顺序 （2）添加剂——表面活性剂 多种 SDS，CTAB，BRIJ，TWEEN 临界胶束浓度（CMC） 与溶质相互作用 吸附在毛细管内壁，改变EOF （2）添加剂——手性选择剂 环糊精，冠醚，胆汁酸盐 CDs （3）温度对CZE分离影响 改变粘度 改变EOF 改变分析时间 改变化学平衡和动力学 2.毛细管内壁改性 溶质与毛细管内壁的相互作用，使分离效率降低 采用极端pH 高离子强度缓冲溶液 内壁改性（静态改性、动态改性） （1）内壁静态改性 形成键合相或粘合相 聚合物与硅醇基反应 （2）毛细管内壁动态改性 改良剂直接加到操作缓冲溶液中 优点：改变其电荷和疏水性 缺点：溶质和毛细管内壁同时受影响；平衡时间要长 3.CZE的应用 生物学领域：多肽和蛋白质的分析 （二）胶束电动色谱 Micellar electreokinetic capillary chromatography( MEKC,MECC ) 1984,Terabe 电泳技术与色谱技术的交叉 优势：分离中性溶质、带电组分 缓冲溶液中加表面活性剂 表面活性剂 非离子型：聚乙二醇，司盘，吐温 离子型：阴离子型C12H25SO4-Na+(SDS)； 阳离子型C18H37NH3+Cl-； 两性：RNH2CHCOOH 1.原理 假固定相（与色谱类似），流动相 胶束迁移方向，EOF方向 一般EOF的移动比胶束迁移快 分离机理：基于胶束与中性分子间的相互作用。 （2）容量因子 （3）分离度 2.如何提高分离度 K’：随表面活性剂浓度增加而线性增加，但会增大EOF 扩大洗脱范围或时间窗口可提高分离度 *采用中等程度的EOF和高迁移率的胶束 MEKC中中性溶质的流出时间窗口 3.分离条件的优化 控制选择性（使用不同表面活性剂，改变缓冲液浓度、pH、温度及使用添加剂） 加有机修饰剂控制溶质——胶束间的相互作用 4.MEKC的应用 氨基酸、核酸、维生素、药物等 MEKC分离治疗感冒药物的成分 （三）毛细管凝胶电泳 Capillary gel electrophoresis 1.原理 基于分子尺寸，让溶质在合适的起“分子筛”作用的聚合物内进行电泳而分离。 又称毛细管筛分电泳 筛分介质（凝胶材料——聚丙烯酰胺） 2.CGE的应用 对DNA分离具有极高的效率 分子生物学： 寡聚核苷酸纯化 反应基因疗法 DNA测序和PCR产物分析 （四）毛细管等电聚焦 Capillary isoelectric focusing(CIEF) 1.原理 依据pI不同分离 毛细管中加入两性电解质建立pH梯度。 阴极（放到碱液中），阳极（酸液），加电压，组分迁移，直到它们到达一个不带电的区域（在其pI处），聚焦。 2.CIEF的应用 测定蛋白质等电点，分离异构体等 五.HPCE的仪器及操作 （一）进样 进样: 区带长度毛细管总长度的1－2％。 样品超载，对分离度不利（峰变宽、峰形畸变） 两种进样方式：流体力学、电动 流体力学：用压力和时间； 电动：电压和时间。 进样体积——Hagen—Poiseuille △P=加在毛细管两端的压力差 d =毛细管内径 t =进样时间 η=缓冲溶液的粘度 L=毛细管的总长度 （二）分离 毛细管 恒温系统 电源 1.毛细管 熔融石英 检测窗口：除去聚酸亚胺保护层 ①老化 老化影响重现性。 用碱液洗去表面的吸附物（用1N NaOH→0.1N的NaOH溶液和缓冲溶液冲洗） ②恒温 重现性：控制毛细管温度。 常用方法：用高速气流和液体恒温。 2.高压电源 使电压稳定在上0.1％。 3.迁移时间/淌度的重现性 ＜0.5%RSD。 毛细管壁 缓冲溶液的组成 pH值和粘度 样品的性质和仪器的质量 （三）检测 2.激光诱导荧光（Laser induce