2细胞培养教材.ppt

东北师范大学 细胞培养基中的氨基酸 合成培养基中至少要有12种适于体外培养细胞的必须氨基酸，比人体所需的必须氨基酸多四种，精氨酸、组氨酸、半胱氨酸和酪氨酸，多为人体的半必需氨基酸。 东北师范大学 培养液中的谷氨酰胺 谷氨酰胺对培养细胞是必须的，参与蛋白质的合成和核酸代谢，并可作为碳源和氮原等能量来源。 谷氨酰胺在溶液中易降解，存放两周的培养液应补加原量的谷氨酰氨。 用二肽谷氨酰氨可以避免降解。 东北师范大学 细胞培养基中的无机盐 无机盐有维持细胞生理渗透压，维持酸碱度，提供所需离子，调节细胞膜功能等。 向培养液中添加其它物质有可能会改变培养液的渗透压。 常见的无机盐有：CaCl2? Ca(NO3)2 CuSO4 KCl? MgSO4 MgCl? Fe(NO3)3 FeSO4 ZnSO4 NaCl ?NaHCO3 NaHCO3? NaH2PO4 KH2PO4 。 东北师范大学 细胞培养基中的酚红 培养基中的酸碱指示剂，pH中性时为樱桃红色。 酚红有类固醇类激素样作用。 酚红颜色对试验有影响时，可选用无酚红的培养基。 东北师范大学 细胞培养基中的抗生素 常用的抗生素有青霉素/链霉素。 庆大霉素/卡那霉素。 四环素/红霉素。 真菌：两性霉素／制霉菌素。 支原体：庆大霉素／四环素／红霉素 抗生素在实验期间最好不用，因为抗生素可能会影响细胞代谢。 东北师范大学 细胞培养基中的缓冲系统 培养液中含NaHCO3，能与CO2构成缓冲系统。 5%的CO2 需1-2g/L， 10%的CO2 需3-4g/L。 细胞培养瓶盖不应拧得太紧,以保证气体交换。 HEPES为良好的生物缓冲剂，具有较好的缓冲能力，可防止培养基pH迅速变动。 注意：受试物对培养液酸碱度产生的影响。 东北师范大学 动物细胞培养基中的添加剂 促生长因子及激素：针对不同培养细胞而定。 结合蛋白和转运蛋白：如转铁蛋白和白蛋白。 特殊添加剂：如提取物，特殊细胞生长需要。 促贴壁物质：如纤粘素、纤维蛋白、明胶和多聚赖氨酸等。 东北师范大学 内皮细胞在不同基质上的生长状态 明胶 纤维蛋白 东北师范大学 细胞培养基中的2-巯基乙醇 2-巯基乙醇有一定刺激细胞增殖作用，同时避免过氧化物对培养细胞的损害。 2-巯基乙醇能促进丝裂原反应和DNA合成。 2-巯基乙醇的常用终浓度为50nM/L。 东北师范大学 细胞培养常用消化试剂 胰蛋白酶可水解细胞表面与贴壁相关的蛋白质。 消化效果与浓度、温度、时间及有无钙镁有关。 多用无钙镁的D-Hanks液配制，浓度0.25-0.5%。 血清能够干扰其消化作用。 EDTA可螯合钙镁离子，与胰酶合用效果更佳。用后应尽量洗去残留。 胶原酶：适于分离富含胶原组织中的细胞。 东北师范大学 培养细胞的传代 细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。 吸去原有培养基，消化1-2分钟，随时观察。 细胞快变圆时加入等体积的完全培养基终止 小心吹打细胞，让细胞悬浮起来。 将细胞吸到离心管中，1000转离心5分钟。 弃清液，加少量培养基，轻轻吹打细胞。 据细胞种细胞种类和密度进行分瓶传代。 东北师范大学 培养细胞的消化过程 东北师范大学 培养细胞的冻存与复苏 东北师范大学 培养细胞的冻存方法 防冻剂：用10% DMSO 或 5-15%甘油，使冰点降低，细胞内水分外移，减少冷冻时细胞内冰晶形成。 冻存方法：将分散好的新鲜细胞悬液等量加入到含2 倍冻存液的冻存管中，混均后封盖。 降温速度：先慢后块，尤其是-25℃之前降温要慢，使冰晶产生在细胞外。可逐步降温或用降温瓶降温。 将细胞保存在液氮（-196度）或-80度冰柜中。 保存时间：-70℃数周，-90℃6个月以上，-196℃可长期保存。 2×防冻剂：20% DMSO，20%血清，60%细胞培养液。 东北师范大学 冻存细胞的复苏 迅速将冻存管放入37度的水中，迅速通过细胞受损温度（-5～0℃），尽量避免冰晶形成。 将细胞悬液移入含10倍体积的完全培养基中，1000转离心10分钟，弃上清，去除冻存保护剂，用培养液悬浮细胞后转入培养瓶培养。 复苏后应保证一定的接种密度。 东北师范大学 培养细胞的长途运输 运输：取生长良好的细胞，在培养瓶中加满培养基，封口膜封口，防震包装。 再生长：将密封培养瓶平放于培养箱中孵育，使运输过程中少数脱落的细胞附着生长。次日进行传代培养。取出的培养基可作为新培养环境的适应培养基。 东北师范大学 再 见 东北师范大学 细胞培养室 东北师范大学 洁净级细胞培养室 东北师范大学 细胞培养器材的清洗 玻璃器皿：新器材多带碱性，刷洗后浸入稀盐酸中和，用过的器皿应先浸泡。 刷洗：不可用力刷洗，损坏表面光洁度。 浸酸：刷洗后的器皿须干燥后再浸入酸洗液中。 冲洗：酸洗后，反复冲洗10次，蒸馏水洗3次。 塑料制品：棉花