3细胞培养的基本条件07说课.ppt

细胞培养的基本条件 培养细胞生长的条件 细胞的营养需要 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 无污染 无毒 　 无菌室结构模式图 无菌工作台操作布局示意图 培养瓶 清洗示意图 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 1. pH7.2 PBS贮备液（10×）配法 NaCl 8.5 g KCl 0.2 g Na2HPO4﹒12H2O 2 .85 g KH2PO4 0.27g 溶于100 ml双蒸水中 2. PBS使用液配法 贮备液 50ml 双蒸水 450ml ◆胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 ◆胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 ◆胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 抗生素液 链霉素 (100ug/ml) 青霉素 (100单位/ml) 制霉菌素 (100单位/ml) 终浓度不超过万分之一为宜 ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分 一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加 10％血清． 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚． 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。 常用的合成培养基 RPMI1640 Eagle培养液： ① MEM ：minimum Eagle medium ② DMEM ：Dulbecco’s modified Eagle medium ③ BME：basal medium Eagle ④ IMDM HamF12、HamF10、 PC199 Mc-Coy5A 附加成分 促贴壁物：层粘连蛋白等 激素：胰岛素、氢化考的松、GH等 生长因子： ECGF、NGF、FGF等 酶抑制物：大豆胰旦白酶抑制剂等 基础培养基 80％一95％ 血清 5％一20％ 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100卑位／毫升 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位／毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10％） 3. 水解乳蛋白（Lactalbumin hydrolysate,LH） 4. 鼠尾胶原 胶原是细胞生长的良好基质，尤其对组织块和细胞的固定附着、