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A Brief Introduction of Next Generation Sequencing  Shaopeng ZHANG Application of Sequencing 全基因组测序 －生成基因组结构概图 －研究DNA序列的组织，分布和信息 －基因筛查：寻找新基因，定位和功能 －和其他基因组进行比较研究 —分子标记的连锁定位 —ChIP研究 Application of Sequencing 比较基因组研究 －识别单碱基突变，分辨纯合/杂合 －识别突变热点和保守区域 －识别插入或者缺失的基因 －断定基因型和表型之间的相关关系（比如，研究药物抗性的遗传基础） － 基于基因测序变化进行毒性预测 －进行流行病学分析 －了解工业生产菌株和它们的亲代菌株序列上的差异作为进行工业生产菌株开发的遗传基础 －进行宏基因组 （metagenomics）研究 －古代化石DNA /线粒体DNA测序研究 Application of Sequencing 转录组和基因调节研究 基于短Tags，ESTs, ChIP，或者GIS-PET序列的高通量转录组分析，或者miRNA 序列的基因组范围识别，小分子和非编码RNA的测序。 研究DNA的甲基化模式来进行基因调节的研究。 扩增产物分析 PCR产物的超精细测序（应用于医学研究的重测序） －在混合的肿瘤样本中识别体细胞突变 －在群体水平上发现高可信度的SNP位点 —产前诊断 —法医学应用 —育种 Review of Sequencing 几乎所有的生物实验室，或多或少都与测序公司有合作 国内外大大小小的测序公司如雨后春笋般涌现出来 每年由测序带来的直接经济效益多以亿计 速度、质量、价格上的PK愈演愈烈 人类基因组计划/6个国家/13年/4.37亿美元/近200台测序仪/几千名科研工作者/3G 现今/一个实验室/一周/2万元人民币/一台测序仪/几名工作人员/300G The Second Generation of Sequencing 2005年 454 第二代测序技术 2006年 ABI收购Agencourt 为二代测序急需能量 2007年1月 illumina 6亿美元收购solexa 2007年3月 Roche 1.5亿美元收购454 2007年底 ABI推出Solid Solid、454、Solexa三分天下 Roche预收购illumina Roche 454 最先提出的二代测序概念 基于聚合酶的焦磷酸测序法和生物发光的原理 Roche品牌效应 测序片段最长（400bp） 速度最快（10h） 通量最低（400M） 对于AAA，GGG等连续同聚碱基的分辨率较低 流程 1、文库制备：根据样品的种类和实验目的，将基因组DNA/cDNA片段化处理至400-800bp间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA（ssDNA） 流程 2、Emulsion ?PCR：特定比例的单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，使大部分磁珠磁珠携带了一个独特的单链DNA片断。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增后仍结合在磁珠上的片段既可被回收纯化用于后续的测序实验；? 流程 3、测序反应：携带DNA的珠子与其他反应物混合物，随后放入PTP板中进行后继的测序。PTP孔的直径（29um）只能容纳一个珠子（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中，测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。 ? 流程 4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析。? 一个片段=一个磁珠=一个读长 Roche 454 实验部分的QC 文库制备流程： 核酸提取及纯化→QC1→打断→QC2→加接头→变性→回收