DNA提取与鉴定说课.ppt

生物化学大实验 实验指导老师 刘晓颖 张萍萍 陈彦 王剑峰 李绍飞 2012-02 生物化学大实验 实验一：动物基因组的制备及其鉴定1 实验二：动物基因组的制备及其鉴定2 实验三：动物基因组的制备及其鉴定3 实验四：糖类化合物的提取及TLC分析1 实验五：糖类化合物的提取及TLC分析2 实验六：Sephadex-G50层析法分离蛋白质 实验七：SDS测定蛋白质分子量 实验八：聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点 生物化学大实验 实验一：动物基因组的制备及其鉴定1 实验二：动物基因组的制备及其鉴定2 实验三：动物基因组的制备及其鉴定3 实验四：糖的分离鉴定—硅胶G薄层层析 实验五：Sephadex-G50层析法分离蛋白质 实验六：蛋白质的FPLC分离与定量测定 实验要求 （1）实验前要预习相关的内容，弄懂原理，了解实验的设计思路，找出实验操作的关键步骤，试剂的配制方法及用量，数据处理的方法等。 （2）实验过程中，要认真，规范的操作。学会安排实验时间和实验顺序。如实记录实验中出现的现象和数据。 （3）使用仪器时要按照说明书去做。发现故障应停止使用。节约试剂。公用试剂用完后，要及时放回原处。 （4）实验报告要及时完成。报告上要注明实验日期及温度。在报告的结果讨中，对实验现象，结果和数据等可进行分析；也可对实验中遇到的问题及实验中需要改进的地方进行讨论。 （5）一般试剂都应用蒸馏水或无离子水(即离子交换水)配制，有特殊要求的除外。 （6）试剂(特别是液体)一经取出，不得放回原瓶，以免因量器或药勺不清洁而沾污整瓶试剂。取固体试剂时，必须使用洁净干燥的药勺。 （7）使用易燃、易爆、有腐蚀性甚至有毒的化学药品时应注意安全，必要时应戴手套，带口罩或防毒面罩，并在通风橱中进行。 （8）实验纪律：不迟到和缺席。实验室的卫生要轮流值日。 成绩评定 平时成绩：考勤 实验技能测试和实验报告等 70～ 60% 期末理论考试： 30 ～ 40% 分离纯化核酸原则与要求 1.应保证核酸一级结构的完整性 　完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求) 2.排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 　纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度； 无其他核酸分子的污染，例如提取DNA分子时，应去除RNA分子 3.减少化学因素对核酸的降解 　 避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH 4～10条件下进行 4. 减少物理因素对核酸的降解 强烈振荡、搅拌，将细胞突置于低渗液中，细胞裂解、反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA分子．对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些 。 5. 防止核酸的生物降解 细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。DNA酶需要Mg2+，Ca2+的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA，柠檬酸盐，可基本抑制DNA酶的活性 RNA酶不但分布广泛，极易污染，而且耐高温、耐酸碱，不易失去活性，所以生物降解是RNA提取过程的主要危害因素。进行核酸分离时最好用新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮或一70℃的冰箱中。 DNA在细胞内的分布 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。 真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的染色体DNA、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子； 95％的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其他5％为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等 RNA分子主要存在于细胞质中，约占75％，另有10％在细胞核中，15％在细胞器中。 大多数生物体内RNA分子均为单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物mRNA分子多数在3＇端带有polyA结构。 DNA的性质 DNA是很惰性的化学物质，双链由氢键紧密相连，其碱基对外侧受磷酸和糖的保护，并由于其内部的碱基堆积力而进一步加强，使DNA在细胞内比其他成分更具化学耐久性。 因此在氯仿等使蛋白质变性的条件下，DNA分子仍然稳定。 真核生物中的染色体DNA与碱性蛋白(组蛋白)结合而成核蛋白(DNP)形式而存在于核内。DNP溶于水和浓盐溶液(1-2mol/L 氯化钠)，但不溶于生理盐溶液中(0.14mol/L 氯化钠)，而RNP此时的溶解度较大，因此可利用这一性质，