cDNA全场扩增说课.ppt

Oligo capping method方法（又称RLM-RACE）是由日本东京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转录起始位点。 目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa（5’-Full RACE kit D315）和Ambion（Firstchoice RLM-RACE kit AM1700）两家都有生产。 5’RACE的扩增 切胶回收 克隆转化 挑取单菌落 菌落PCR检测 公司测序 5’RACE 414bp 5’RACE序列的分析 将测序得到的结果去载体与接头 接下来，将5’RACE结果与中间片段以及3’RACE片段采用DNAMAN软件进行拼接 End to end实验 在采用DNAMAN软件将克隆得到的中间片段、3’RACE片段以及5’RACE片段进行拼接后，我们还需要在序列结合处的两侧设计引物，进行end to end PCR，以确保所获得的序列是真实存在的，同时所设计引物的位置最好在开放阅读框的两侧。 同源序列比对分析 RACE技术的关键环节 RACE 技术的关键环节： 1. RNA的质量 2. RACE的引物 存在的问题及解决办法 反转录 RNA的质量 有高质量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至关重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作没有结果既浪费时间又浪费试剂，给试验带来麻烦。 反转录提前终止 模板中有特殊的二级结构，反转录提前终止。通过提高反转录的温度，加大反转录的反应体系以及反转录过程中一直保持已变性的RNA模板处于50℃以上，避免已解开二级结构的RNA再恢复原来的结构，以达到5’末端。 RACE技术主要是应用于对全长cDNA序列的获得，但对该技术进行一定的修改后，也可在其它方面显示出极高的应用价值。 　　一、RACE技术可用于cDNA文库的构建及筛选。 　　二、应用RACE克隆已知片段的旁侧内部序列(neighboring internal sequence)。Fritz等(1991)以及Struck等(1994)分别用该法获得了3’端和5’端的旁侧序列。 　　 　　三、RACE可用于克隆同源基因的同源片段，为寻找同源基因提供了一种手段。 　　总之,随着RACE技术的不断改进和完善,优化PCR扩增的条件以提高扩增的效率和忠实性，RACE技术必将在基因克隆以及基因家族和基因表达变化等研究中发挥极大的作用。 * * * cDNA Synthesis And Gene Cloning 金萍 南京师范大学生命科学学院动物遗传资源研究所 RNA提取 PCR扩增 cDNA合成 浓度（C）和纯度（A260/280）检测 cDNA扩增流程 RNA保护试剂 凝胶回收DNA 设计特异引物 组织样品 PCR法筛选阳性克隆 设计引物 纯化的DNA Express sequence tag，EST RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术进行基因cDNA全长扩增 文昌鱼LITAF基因全长的克隆 5’RACE LITAF基因 中间片段 3’RACE Lipopolysaccharide-Induced TNF Factor 总RNA抽提 所有接触总RNA的试剂、器材等（包括配试剂用的H2O）均经0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯 ）水处理，玻璃器皿于180℃烘箱烘烤6-8小时。 提取总RNA按mirVana? miRNA Isolation Kit（Ambion公司）说明书于超净台中操作（如图），提取的RNA分取部分进行纯度和完整性检测，其余于-80℃保存。 安全柜 总RNA提取过程 总RNA的浓度和纯度检测 总RNA的完整性检测 琼脂糖凝胶电泳检测得到两条清晰的谱带，分别为28S和18S。说明提取的总RNA完整性好，可进行下游实验操作。 28S 18S LITAF基因中间片段的克隆 cDNA模版的合成 1）RNA 2）oligodT引物、random引物 3）反转录酶（M-MLV……） 4）Rnase Inhibitor 5）dNTP 6）H2O 引物设计 可以根据数据库中已有数据设计特异性引物或基因不同物种中的保守结构域设计兼并引物 一般引物的长度为18-30bp，常用的长度为20-24bp，过长或过短都不合适。 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 引物所对应模板序列的Tm值最好在50-70℃之间，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。 PCR法进行中间片段的扩增 以反转录好的cDNA作为模板，利用合成好的特异性引物或兼并引物进行中间片段的扩增。 切胶回收