western技术.doc.doc

非常详细的-Western Blot常见问题分析 1?? ? ???WB用的最适封闭液往往具有系统依赖性。决定合适的封闭液可能增加系统的信号信噪比。有时，从一个底物转换到另一个底物时，所用的封闭液会使信号减少或增加背景。对系统进行不同封闭液的尝试可能达到最好的结果。避免使用牛奶做封闭试剂，依赖其抗生素蛋白，因为牛奶含有很多生物素。尽管超级封闭液会有很好的效果，但我们还是建议在一个特定系统中尝试用几种封闭试剂，因为没有一种最优封闭试剂适合所有系统。 2??一抗的选择 一抗如何选择 免疫印迹中一抗的选择取决于被检测抗原和能识别抗原的抗体。市场上销售的一抗有很多种，都可以通过查找站点快速查找识别（如?或 ）。另外，也可制备能识别感兴趣抗原的一抗。多克隆抗体和单克隆抗体都在免疫印迹中都能应用，多克隆抗体相对便宜，制备时间较短，而且对抗原都具有很高的亲和力。单克隆抗体以其特异性强、纯度高、浓度高及产生的背景低占优势。粗制抗体例如血清或腹水有时也用于免疫印迹，但是其中的杂质会增加背景。为了获得强特异性的抗体，可以用固定抗原进行亲和纯化。 Western Blotting的抗体溶液往往要将1 mg/ml的原液稀释1/100- 1/500000。每个检测系统的最优抗体浓度都需要实验确定。较敏感的检测系统需要少量抗体，从而降低抗体成本，并且可以用有限的供应量进行更多的实验。另外，因为亲和力高，抗体量少，产生的背景也少。抗体稀释液通常是包含封闭试剂的洗脱液，抗体稀释液中少量的封闭试剂和去垢剂往往有利于最大限度的减少背景。 在免疫印迹中使用的标记二抗包括生物素、荧光素、罗丹明、DyLight染料、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。 3??优化抗原和抗体浓度的斑点杂交方法 斑点杂交方法——优化抗原和抗体浓度 对于一个给定的抗原，最佳的抗体浓度依赖的抗原和抗体本身。抗原和抗体的亲和力，以及一抗与二抗的特异反应都是不同的。最优抗原和抗体浓度可通过免疫印迹实验中使用不同浓度的抗原和抗体作用确定。另外，更快和更简单的方法是进行斑点印迹实验。以下是使用超敏感信号底物进行的斑点印迹的操作方法。 注：所有的抗体稀释度假定起始浓度为1 mg/mL。 1.?用TBS和PBS稀释的蛋白样品，好的稀释方法是由样品中的抗原稀释浓度决定的，但是由于抗原的浓度是未知的，所以有必要进行宽范围的稀释度的检测。SuperSignal West Pic化学发光底物的检测灵敏度可达皮g水平，所以样品的稀释范围可以从微克水平到皮克水平。如果要使用过多的抗原，结果会出现以下情况：非特异性条带、模糊条带和信号降低。 2.?准备转印膜。所需膜的数量依赖于被屏蔽的一抗和/或二抗有多少种不同稀释浓度。通常，一种或两种一抗的稀释度是用两种或三种不同的二抗稀释度进行测定的。例如：1/1000的一抗和1/50000的二抗；1/1000的一抗和1/100000的二抗；1/5000的一抗和1/50000的二抗；以及1/5000和1/100000的二抗。 3.?将膜放在滤纸上。将抗原稀释液点在膜上。用尽可能小量的稀释液点在膜上（2-5 ul为宜），因为用的体积越大，信号越弥散。抗原溶液在膜上干10-30分钟或直至无可见的水分。 4.?用含0.05%的Tween-20封闭液封闭膜上的非特异性点，室温震荡孵育1 h。 5.?将一抗稀释到封闭液/Tween-20去污剂中，并加到膜上，室温震荡孵育1h。 6.?用TBS或PBS洗膜4-6次，用尽可能大体积的洗脱液， 在洗脱液中加入0.05%的吐温，用以减少非特异背景。每次洗脱过程中，使膜悬浮在洗脱液中震荡大约5分钟，倒出洗脱液并重复。孵育前，在洗脱液中短时间的漂洗可能会增加洗脱效率。 7.?制备二抗/HRP结合的封闭试剂/Tween-20去垢剂稀释液，将二抗稀释液加到膜上震荡孵育1 h。 8.?按第6步方法再次清洗膜。 9.?准备底物工作缓冲液，混合等体积的鲁米诺/增强剂和稳定的过氧化物溶液。制备足够体积确保印迹点完全湿润，保证印迹点在孵育过程中不会干。推荐体积：0.1 ml/cm2印迹面。 10.?将膜在超感应显色底物工作液中孵育5分钟； 11.?将膜从底物上移除，放到塑料布或其它防护膜上； 12.?将印迹贴到胶片上，在蛋白旁边曝光。任何标准的或者增强的放射自显影胶片都可以用。推荐第一次曝光30-60 s，为得到最佳结果，曝光时间可不同。另外，也可用CCD相机或其它成像设施；然而这些设施可能需要更长的曝光时间。 13.?在最佳的印迹膜上，超感应反应底物产生的信号可能会持续超过8 h。未获得最佳结果，印迹能重复曝光到胶片上或者成像系统中。随印迹时间的延长，需延长曝光时间。如果未得到最佳结果，可用抗原和/或抗体稀释液重复进行这个程序。 4??电泳中的问题