基于数字PCR方法研究小檗碱干预脂肪胰岛素抵抗细胞抵抗素和瘦素.doc

小檗碱对脂肪胰岛素抵抗细胞PPARγ及脂肪分泌因子表达的影响 涂珺*，罗新新，李冰涛，黎宇，徐国良 （江西省中医病因学重点实验室，江西中医药大学，江西南昌 330004） [摘要] 脂肪分泌细胞因子与脂肪组织胰岛素抵抗(IR)密切相关，在糖尿病的发生发展研究中越来越受到重视。研究小檗碱对脂肪胰岛素抵抗（IR）细胞PPARγ和脂肪分泌因子mRNA表达的影响来探讨小檗碱增强胰岛素敏感性的分子机制及微滴数字PCR（ddPCR）方法的应用优势。本实验采用ddPCR绝对定量分析简单直观确定合适的内参基因，ddPCR和荧光定量法(qPCR)方法比较研究不同剂量(10μM，20μM，50μM和100μM)小檗碱干预IR 3T3-L1脂肪细胞中PPARγ、脂联素、抵抗素和瘦素mRNA表达；加入GW9662研究PPARγ和脂联素m表达的内在关联ddPCR结果发现β-Actin表达稳定，适合作为内参基因对定量PCR数据标准化。 ddPCR和qPCR方法均显示与IR模型组相比，10μM，20μM，50μM和100μM小檗碱呈现剂量依赖降低脂联素mRNA表达（P0.01）。对于PPARγ，qPCR显示20μM，50μM和100μM小檗碱呈现剂量依赖降低其表达（P0.01），而ddPCR仅在50μM和100μM 两个浓度降低其表达（P0.05）。PPARγ特异拮抗剂GW9662干预实验表明脂联素基因表达受PPARγ直接调控(P0.05)。ddPCR探针法检测各剂量小檗碱均剂量依赖降低抵抗素和瘦素mRNA表达（P0.01）。小檗碱调节脂联素起到胰岛素增敏作用并非通过PPARγ依赖途径在转录调控水平上调脂联素表达，推测可能是在翻译后调控水平上调高聚体脂联素比例。小檗碱下调抵抗素和瘦素表达减轻脂解改善IR。ddPCR比q具有更好线性范围和灵敏度，对低丰度表达基因检测具有明显的技术优势。 [关键词] 小檗碱 胰岛素抵抗 PPARγ 脂肪细胞因子 微滴数字PCR（ddPCR） 近年来的临床调查发现我国18岁以上糖尿病患者多达1.139亿[1]，控制血糖是防治糖尿病的关键。中药临床辨证治疗，黄连为主要的系列经方广泛用于糖尿病发生发展和不同阶段。小檗碱是从黄连中分离出的一种异喹啉生物碱，临床研究显示小檗碱能显著降低糖尿病患者的体重和血糖血脂及炎症因子，提高脂联素浓度，降低瘦素水平，改善胰岛素抵抗(IR)，疗效显著且安全性较高[2-3]。动物实验研究表明小檗碱能提高胰岛素受体的表达、促进糖酵解、增强胰岛素敏感性、促进胰岛素的释放与分泌，具有良好的降糖效果[4-5]。小檗碱改善IR的机制研究有助指导其在尿病上的临床用药。本实验作者对不同剂量小檗碱对IR脂肪细胞PPARγ及脂肪分泌因子mRNA表达进行研究。考虑到瘦素和抵抗素的低丰度表达，本实验采用必威体育精装版的微滴数字PCR (ddPCR)荧光定量（qPCR）检测不同剂量干预下各组PPARγ和脂肪分泌因子mRNA表达变化差异。 材料 1 仪器 Nanodrop 2000核酸蛋白测定仪和ABI 7500型Real-time PCR仪，美国Thermofisher公司；QX200微滴式数字PCR系统，美国Bio-Rad公司；Eppendorf 5424R型冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Spectra Max Plus384全波长酶标仪，美国?Molecular Devices公司。 2 试剂 盐酸小檗碱(中国食品药品检定研究院，批号：110713-201212)，罗格列酮，GW9662，地塞米[基金项目]：江西省卫生厅中医药科研项目（2013A11）； [通信作者]：涂珺，教授，主要从事中药药理学和分子药理学研究，Tel：0791E-mail：jtu2012@163.com。松，IBMX和胰岛素购自Sigma公司（批号：122320-73-4，BGBC1877V，D8040，STBC7632V和I5500），TNF-α（Protech，070473）。高糖DMEM（Hyclone，批号：1280）、新生牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批号：140625），胎牛血清(全式金生物科技有限公司，批号：G20701)，Trizol和PureLinkTM RNA Mini Kit ( Life technologies，批号：74121和1502889A)；GoScriptTM Reverse Transcription System (Promega，批号：000013889)；DNase-free water (Qiagen，批号：129115)；Power SYBR? Green PCR Master Mix和Taqman Gene Expression PCR Master Mix，FAM