第14章基因重组和基因工程剖析.ppt

* * * * * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 * * * * * * * * * * * * 乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖 乳糖类似物异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（IPTG） 有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。 LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物 蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验） 诱导物 Z Y X P O Z Y X P O 乳糖 标志补救（?-半乳糖苷酶法） lacZ Am N2H ?片段 COOH ?片段 lacZ X-gal Lac Z 蓝色化合物 X-gal α互补（蓝白筛选） （LacZ基因 N端序列） 插入片段 （LacZ基因失活） LacZ基因 C端序列 LacZ酶 Southern印迹 （3）分子杂交法 原位杂交 当溶液中的DNA分子经高温或高pH处理后，DNA双链分子变性产生两条单链，如果将温度逐渐下降或pH恢复到中性，单链会按照碱基互补配对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条单链的来源不同，只要它们之间的碱基顺序同源互补或者部分同源互补，在条件适宜时，就可以全部或部分复性——分子杂交。 * 原位杂交技术 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 DNA-DNA RNA-DNA 三类杂交 RNA-RNA 优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。 以特异序列为探针鉴定rDNA在染色体上的分布 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 免疫学方法 重组DNA技术操作过程为： 小结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体细胞 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 （六）克隆基因的表达 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足： 不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白。 1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用) 大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌 真核基因在原核系统表达的困难及其解决方法 将真核基因克隆到1个强大的原核promotor和SD的下游，使真核基因处于原核启动子的控制之下，转录物由于原核SD能与核糖体rRNA结合，可在原核表达.这是克服1、2困难的好办法。 真核分离出mRNA并逆转录成cDNA，cDNA有完整的编码顺序，但无内含子。 采用伪装办法：将真核基因插到原核基因某密码之后，其翻译产物N端有原核多肽，这样表达的融合蛋白，可躲避细菌蛋白酶降解作用。 1.细菌RNApol不能识别真核的promotor，故真核基因不能被该酶转录. 2.从真核转录的mRNA缺乏SD序列,不能结合到细菌核糖体rRNA,因此不能被翻译成蛋白. 3.真核基因有内含子,而原核细胞缺乏真核细胞转录后加工系统,成熟的mRNA不能形成,不能表达真核蛋白 ; 4.表达的真核蛋白在原核细胞中不稳定,易被细菌蛋白酶降解. 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2.真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞） 表达载体pFASTBACI 的物理图谱 一、疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆之