04-5细胞融合2.ppt

第5章 细胞融合 一、 定义 细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过物理、生物或化学方法融合形成单个细胞的过程。 细胞融合（Cell fusion）又称体细胞杂交（Somatic hybridization），是指将不同来源的原生质体(除去细胞壁的细胞)相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。 可以避开生殖细胞的受精过程，在亲缘更远的物种间实现基因转移，创造出自然界中所没有的新物种。 原理：将两个来源不同的原生质体或细胞通过物理或化学方法诱导其细胞融合形成杂种细胞,继而再以适当的技术进行杂种细胞分检和培养,促使细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直至形成杂种植株，从而实现远源物种间的转移——随机结合、融合 显微镜下的细胞融合过程 甜菜原生质体电融合过程 融合过程中两个细胞膜的变化过程 类脂质分子发生扰动和重排 导致细胞桥的形成 细胞质、核相互融合 三、 发展历史 细胞融合现象最初是在动物细胞中发现的。1858年菲尔绍夫发现正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞情况。天花病人血液中也有多核体细胞存在。 1875年Lange第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生的合并现象。 1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。 1965年英国海利斯等进一步证实灭活的病毒在适当的条件下可以诱发动物细胞融合，不同的动物细胞可以被诱导融合，并可以存活。 20世纪七十年代初，华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇(PEG) 能促使植物原生质体融合，开拓了植物细胞融合的研究。 1972年卡尔森等通过两个烟草品种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。 1978年梅尔彻斯(Melchers)等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种——“Potamato”。 目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代，获得了有价值的 新品系或育种上有用的新材料。 细胞融合技术逐步扩展到植物细胞和微生物细胞。伴随者细胞融合技术的成熟，20世纪80年代，真正意义上的细胞工程诞生了。细胞融合现已成为细胞工程的核心技术之一。 四 细胞融合的关键技术 （一）融合材料的获得 问题一：怎样获得植物细胞与动物的单个细胞？？ （二）细胞融合的方法 1、物理法--电融合诱导法 (1) 基本原理 在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧电荷和氧化还原电位发生改变，产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄，触发膜的穿孔，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭合成完整的膜融合体。 (2)特点： 融合率高、重复性与可控制性强。 装置精巧、方便简单。 可在显微镜下观察或录像融合过程。 可能会造成不可恢复的细胞损伤。 (4)电融合诱导法基本过程 电融合装置的电极有两种：微电极型和平行多电极型： （l）将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室中，微电极型只有一个小室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3mm，整个装置放在一个培养皿中。 （2）微电极型的两个电极的端部同时与两个靠近的原生质体膜表面接触，微电极所产生的5－12mA的脉冲电流间断刺激l－5ms，原生质体在累计几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，经点连接到面连接，最后形成融合体，整个过程大约10－30min。 （3）平行多电极通过1兆赫（MHz）交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力的作用下，极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状。在适当时间和强度（如 50mA 1．2－ 2kV／cm）的直流电脉冲作用下，质膜被击穿，进一步形成融合体。 2、生物法 各种病毒都具有凝集细胞的能力，它一边粘接在一个细胞表面，另外一边粘接在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。 (1) 特点 研究最早的促融剂。 毒性大而使应用受到限制。 仙台病毒（HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。 (2) 病毒促使细胞融合的主要步骤 A 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近。 B 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透。 C 两个原生质体的细胞核互相融合，融为一体。 D 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。 (3) 原理与过程 灭活后的病毒颗粒结合到原生质体表面。两受体细胞开始凝聚。 两细胞的膜紧密结合。病毒被膜与受体细胞的浆膜融合。病毒颗粒周围的膜脱离整个膜，产生破口，在两细胞间形成细胞质通道（37度下1-2