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第九章 生物酶工程 酶的筛选 分子筛选；基于序列的筛选。 基于基因的同源性，从已知酶蛋白出发，利用PCR技术或southern杂交，分离克隆目的酶基因。 宏基因组方法（metagenome） 土样—分离收集DNA片断—限制酶剪切—PCR扩增—克隆到载体内—转化（大肠杆菌）—筛选转化株—功能基因—新酶。 (1)克隆酶：用基因工程技术大量生产酶； (2)突变酶：修饰酶基因，产生遗传修饰酶； (3)新酶：设计新酶基因，合成自然世界不曾有的新酶。 一、克隆酶 ①?动植物产生的酶 ②?有害的、未经批准的微生物产生的酶 ③?不可培养微生物产生的酶 酶基因的克隆及表达 二、突变酶 酶基因的遗传修饰：人为地将酶基因中个别核苷酸加以修饰或更换，从而改变酶蛋白分子某个或几个氨基酸，使酶变得更有利于人类利用的目的。 自然遗传修饰：用化学诱变剂或物理诱变因素，作用于活细胞，使其基因发生突变，从中筛选有用的突变体。 射线（紫外线、X射线、γ射线等） 化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等） 选择性遗传修饰：按照预定的目标(突变位点)，通过核苷酸的置换、插入或删除，获得突变酶基因。 1.寡核苷酸置换的定点突变法 利用一段人工合成的具有突变序列的寡核昔酸片段，取代野生型基因中的相应序列 2.寡核苷酸诱导的定点突变 利用带有预定突变序列的寡核苷酸单链引物，在体外与原基因序列退火，诱导合成少量完整的突变基因 3. PCR诱变 三．新酶—酶的遗传设计 设计绘制具有优良性状的超自然的新酶基因图案。 在确定设计目标后， 先根据一定规则产生初始序列， 经过结构预测和构建模型， 对序列进行初步的修改， 然后进行基因表达或多肽合成， 再经结构检测，确定是否与原定目 标相符。 根据检测结果，指导进一步的设计。 四、酶分子的定向进化(directed evolution) 从一个 或多个已经存在的亲本酶（天然的或人工改造的），经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选获得预先期望的具有某些特性的进化酶。 1.酶分子的进化潜力。 天然酶在生物体内存在的环境与酶的实际应用环境不同。 生物对环境适应的进化主要不是表现为某个酶分子的活力和稳定性的不断提高，而是在于整体的适应能力，调控能力的增强。 某些酶待进化的性质不是其在生物体内所涉及的。 定向进化的基本过程 通常分为3步 通过随机突变或（和）基因体外重组创造基因多样性； 导入适当载体后构建突变文库； 通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。 2．定向进化的策略 ①??易错PCR技术 在扩增目的基因时，通过调整反应条件，从而向目的基因中，以一定的频率随机引入突变构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。 ② DNA改组技术 将已经获得的存在于不同基因中的正突变结合在一起形成新的突变基因库。 DNA改组原理 3.交错延伸 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步,并大大缩短其反应时间),从而只能合成出非常短的新生链,经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸.此过程反复进行,直到产生完整的基因长度,结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子. 目标酶 所需功能 方法 结果 实施菌种 卡那霉素核苷基转移酶 热稳定性 定位诱变+选择 在60-50℃酶半衰期增加200倍 耐热脂肪芽孢杆菌 枯草杆菌蛋白酶 作用于有机溶剂 易错PCR+选择 在60％二甲基亚砜中活力增强170倍 枯草杆菌 β-内酰胺酶 作用于新底物 DNA改组+选择 对cefotaxime的抗性增加32000倍 大肠杆菌 对硝基苯酯酶 有机溶剂中的底物特异性和活性 易错PCR+重组 活力增加60-150倍 大肠杆菌 胸苷激酶 第五特异性 基因理疗 交错延伸+选择 活力增加43倍 大肠杆菌 β-半乳糖苷酶 底物特异性 DNA改组+选择 活力增加66倍底物特异性增加1000倍 大肠杆菌 砷酸脱毒途径 砷酸抗性 DNA改组+选择 抗性增加12倍 大肠杆菌 定向进化的应用 五、杂合酶 把来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分子进行组合或交换，以产生具有所需性质的优化酶杂合体。 * *