第二章连接酶及其他(二)ppt.ppt

? 逆转录酶 四、用途 逆转录酶在基因工程中可用于cDNA的合成。即可将任何真核基因的mRNA经反转录形成cDNA拷贝,然后构建克隆,大量扩增,并表达这种基因,从而为真核基因的研究与其核遗传工程提供了一项必不可少的手段。 75 一、性质 末端转移酶催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3′-OH末端。 这很像DNA聚合酶通过5′ 3′聚合5′-脱氧核苷三磷酸合成一条DNA链。所不同的是末端转移酶不需要模板。 第四节 末端转移酶 76 * 第二节 DNA连接酶 一、DNA连接酶的基本性质 1.修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键 43 2.修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷酸 二酯键 一、DNA连接酶的基本性质 44 一、DNA连接酶的基本性质 3.连接多个平头双链DNA分子： 注意： （1）DNA连接酶只能连接相邻核苷酸之间的切口 （nick）； （2）如果是缺少一个或几个核苷酸的裂口 （gap），DNA连接酶是无法连接的； 46 （3）DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子或 环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须 是双螺旋DNA分子的一部分； （4）DNA连接酶催化的连接反应是需要能量 的：在大肠杆菌或其他细菌中，利用NAD+ （烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），在动物细胞 中及噬菌体中，利用ATP（腺苷三磷酸）。 注意： 47 T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶 T4噬菌体RNA连接酶 二、DNA连接酶的种类 ? T4噬菌体DNA连接酶 该酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，是T4噬菌体基因30编码的产物，分子量为68ku，需要ATP作为辅助因子。 两个带有互补粘性末端的双链DNA分子 一条带有切口的双链DNA分子 两个带有平头末端的双链DNA分子 DNA-RNA杂合体分子中切口 该酶可连接 49 ? 大肠杆菌DNA连接酶 该酶是从正常的大肠杆菌中提取的，由大肠杆菌基因组中lig基因编码，分子量为75ku，需要NAD+作为辅助因子。 具有同源互补粘性末端的不同DNA分子 一条带有切口的双链DNA分子 该酶可连接 但,该酶几乎不能催化两个平头末端DNA分子的连接 T4噬菌体DNA连接酶 该酶在DNA体外重组中比大肠杆菌DNA连接酶应用广泛(既能连接粘性末端,也能连接平头末端). 两 种 酶 各 自 的 优 点 大肠杆菌DNA连接酶: 该酶的连接产物转化细菌后,假阳性背景低(由于它对DNA末端的要求比较严格-----互补粘性末端). 52 ? T4噬菌体RNA连接酶 T4噬菌体RNA连接酶由T4噬菌体基因63编码,需要ATP作为辅助因子. 连接反应: 主要用途: 对RNA进行3′末端标记,即将32P标记的3′,5′-二磷酸单核苷加到RNA的3′端. 该酶可催化单链DNA或RNA的5′磷酸与相邻的3′ 羟基、单核苷酸共价连接. 53 第三节 DNA聚合酶 一、DNA聚合酶的分类 根据DNA聚合酶所使用模板的不同,可分为: 依赖于DNA的DNA聚合酶 依赖于RNA的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow大片段酶 T4噬菌体 DNA聚合酶 T7噬菌体 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 逆转录酶 55 ? 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 1.DNA聚合酶的分类 目前,从大肠杆菌中已分离出3种DNA聚合酶,分别为: DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶Ⅱ DNA聚合酶Ⅲ : 与DNA复制有关 主要参与DNA的修复 分子克隆中常用DNA聚合酶Ⅰ 2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质 ? 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是Kronberg等1956年发现的第一个DNA聚合酶,故也称为Kronberg酶. ① 5′ 3′DNA聚合酶活性 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(DNApolⅠ)发挥聚合酶活性需要:DNA模板、引物、dNTP和Mg2+。 57 2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质 ② 3′ 5′核酸外切酶活性 ? 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 该活性识别单链，能将复制过程中3′端的错配碱基切除，从而保证DNA复制的高保真度，也称为校对功能。 DNA polⅠ 5′ 3′ 5′ 58 ③ 5′ 3′核酸外切酶活性 ? 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质 5 3 5 3 5 5 3 3 5 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 -P 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 -P 5′ 3′外切核酸酶活性的水解作用有3个特征： 待切除的核酸分子必须具有5′端磷酸基团。