第四章_抗体制药ppt.ppt

（4）细胞融合：取实验所得的各种溶液和培养基，包括胎牛血清、HT液、A液，在37℃水浴中保温。将上述得到的B淋巴细胞（1×108）和骨髓瘤细胞悬浮液（2×107－3×107）按细胞浓度5：1（或10：1）比例混合均匀，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在2 min以内. （5）培养：培养板放在37℃的5%CO2培养箱中培养，5天左右可以出现新的克隆，未融合的骨髓瘤细胞在一周后死亡，脾细胞在5-6天后死亡。培养过程中培养基需要替换。 脾-瘤融合的杂交瘤细胞:生长 脾-瘤融合的杂交瘤细胞:可利用HGPRT酶，用次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。 抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。 ELISA用于破伤风抗体的筛选 酶联免疫吸附法(ELISA) 抗原 第1抗体 酶 第2抗体 待检杂交瘤培养上清液 底物 有色产物 酶标仪检测 技术原理： 7、克隆化 常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。 有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HAT培养液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培养液。 软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培养。 有限稀释法--- (a) 取96孔微孔培养板，每孔接种0.1ml小鼠的脾细胞或巨噬细胞悬浮液作为饲养细胞，浓度为1mlHAT-RMPI1640-40%FSC（原代培养贮脂细胞）-2ME10-4mol/L溶液中含饲养细胞2X106个，于37℃CO2培养箱中温育； (b) 然后取阳性孔中的杂交瘤细胞用同样溶液稀释到浓度为600细胞/ml。再进行8个双倍稀释，使细胞浓度分别为300、150、75、38、19、10、5、2细胞/ml； (c) 各取每个稀释度细胞液0.1ml加到含有饲养细胞的培养板每一行中的 每个小孔内，使每板每孔的细胞浓度分别在30—0.2个之间，将微孔板置于37℃5%CO2的培养箱中保温培养，2周后可见集落出现； 第二节 鼠源性单克抗体的改造 1、Ig分子的结构模式图 V：可变区； CDR: 抗体分子和抗原分子发生特异性结合的关键部位 C：恒定区；决定Ig分子的异种抗原性 改造目的：一是降低免疫源性；二是降低相对分子量，增加组织通透性。 改造原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（V），同种性、免疫源性则决定于抗体分子的稳定区（C）。 单抗结构改造的主要方法： （1）人—鼠嵌合抗体（chimeras antibody）的制备 ：在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的H和L链的V区基因分离出来，分别与人Ig的H链和L链的C区基因连接，即成为人—鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的人—鼠嵌合抗体。 2、鼠源性单克隆抗体的改造 （2）改型抗体：H和L链 V区中的互补性决定区 (抗原结合部位：CDR区) 是由Ig分子中参与构成的。如果用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人 Ig分子中的CDR序列，则可使人的 Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性（结合部位）。抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫源性。这种改型抗体也称CDR移植抗体 (CDR grafting antibody)。 第三节 抗体诊断试剂和抗体治疗药物 * * 第四章 抗 体 制 药 1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开了抗体制药之先河。 1937年Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（α）球蛋白、乙种（ β ）球蛋白、丙种（ γ ）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。 抗体是指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 病人血清中具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白，称为免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念，所有抗体是Ig，但并非所有Ig分子都有抗体活性。 由于病原微生物是含有多种抗原决定族的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称为多克隆抗体。易出现非特异性交叉反应。 1975年K?hler and Milstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出 McAb，在临床上主要用于诊断和治疗。 抗体分子 抗体