免疫检验第十二章免疫组化课程.ppt

抗原 底物 PAP法 桥抗体 PAP复合物 第一抗与第三抗的动物种属须相同 操作只需三步 PAP复合物稳定，酶不易洗脱，避免了酶桥法的弊端 大大减弱背景着色 ① 桥连抗体存在的非特异性抗体，因其与第1抗体并非同种属，不能与抗酶抗体结合 ② 抗酶抗体中存在的非抗酶抗体，虽可与组织成分结合，但此抗体不能与酶结合，不会有酶活性。 + + + 底物 二抗/Ab2 兔源一抗/Ab1 Ag 兔源PAP复合物 Ag Ag Ag Ag-Ab1-Ab2-PAP复合物 （三）双桥PAP法 基本原理:是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上。这种放大方式由于重复使用桥抗体，使桥抗与PAP复合物中的抗酶抗体未充分饱和的Fc段结合，或桥抗体与特异性一抗尚未饱和的Fc段结合。对抗原有明显放大作用，对于组织细胞微量抗原的检测更有实用价值。 抗原 底物 双桥PAP法 桥抗体 第一抗与第三抗的动物种属须相同 PAP复合物 四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物 常用种类: 辣根过氧化物酶/HRP底物显色（DAB)棕色或灰蓝色(AEC) 最常用 碱性磷酸酶/AP 底物显色玫瑰红色(α-萘酚磷酸盐与快红反应）或深蓝色 (α-萘酚磷酸盐与快蓝反应）;靛蓝四唑（紫蓝色） 最敏感 葡萄糖氧化酶/GO 底物为葡萄糖，配以NBT和PMS显色蓝色 敏感性较低，显色底物不易保存 β-半乳糖酶等 酶的选择: HRP染色结果比AP染色结果保存时间长 含有内源性HRP的组织切片:首选标记酶为AP AP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记,对比清晰 采用荧光素标记已知抗体（或抗原）作为探针，检测标本中靶抗原（或抗体），在荧光显微镜下，分辨出抗原(或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量。以达到对抗原(或抗体）物质定位、定性和定量测定的目的。 ★荧光免疫组织化学技术 一、组 织 的 处 理 标本的类型： 涂片和印片 组织切片 细胞培养标本 活细胞 标本的保存 ： 标本固定干燥后，最好立即检测 保持干燥、置4℃甚至-20℃ 以下保存 二、荧光免疫组化染色 直接法： 优点：操作简便、特异性高 缺点：敏感度偏低、抗体制备麻烦 间接法： 优点：较直接法灵敏，标记一种抗 体可以鉴定多种抗原 缺点：非特异荧光、操作时间较长 双标记荧光免疫染色法 用两种荧光素分别标记 不同抗体，对同一标本 中的相应两种抗原同时 检测 标记抗体A 抗原A 抗原B 标记抗体B 标本 载玻片 亲和组织化学（Affinity histochemistry） 利用两种物质之间的高度亲合力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素（与蛋白糖基）、生物素（亲和素）和葡萄球菌A蛋白（IgG FC段结合）等，都对某种组织成分具有高亲和力的特点，可以与标记物如荧光素、酶、同位素、铁蛋白及胶体金等结合,可采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应、放射自显影或电子显微镜，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位或定量。 待测抗原 非特异性抗原 A-亲合素 B-生物素 E-酶 ABC 直接法原理示意图 原理：预先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合形成可溶性的ABC复合物。当其与检测反应体系中的生物素化抗体相遇时，ABC中末饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原－抗体反应体系与ABC标记体系连成一体进行检测。 （一) 亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术ABC ABC 间接法原理示意图 待测抗原 非特异性抗原 A-亲合素 B-生物素 E-酶 原理：预先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合形成可溶性的ABC复合物。当其与检测反应体系中的生物素化第二抗体相遇时，ABC中末饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原－抗体反应体系与ABC标记体系连成一体进行检测。 缺点： 有些组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺等有内源性生物素活性，需要对组织进行预处理 ?ABC复合物在中性时带正电荷，容易与细胞核等带负电荷结构非特异结合，亲合素为糖蛋白，可以与凝集素等碳水化合物结合 优点： 敏感性高 特异性高 一抗和二抗工作浓度低 操作时间缩短 可以多重标记 (二）桥联亲合素-生物素技术Bridged Avidin-Biotin technique， BRAB 原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素(酶标生物素)联结起来，达到检测反应分