免疫学技术与方法课程.ppt

第十二章免 疫 学 技 术 与 方 法 指与细胞免疫有关的各种检测技术，包括对免疫细胞、细胞因子的检测及功能分析。 指制备与免疫检测有关的各种试剂，包括抗原制备、抗体制备及抗体标记等技术。 一、抗原抗体反应的原理 抗原抗体 结合力的大小 亲和力（affinity）： 亲合力（avidity） 指整个抗体分子与抗原之间结合的强度 (all pointsall points) 与抗体的结合价直接相关。亲合力高，与抗原结合牢固不易解离。 二、抗原抗体反应的特点 （二）比例性 (proportionality) 1、带现象:在抗原抗体反应等价带前后,由于抗体或抗原过量,上清液中可测出游离的抗体或抗原,形成的沉淀物少,不出现可见反应,这种现象称为带现象 2、等价带:抗原抗体反应曲线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围,称为抗原抗体反应的等价带。在此范围内,抗原抗体充分结合,沉淀物形成快而多。 3、前带现象:抗体量过剩时,不出现可见反应。 4、后带现象:抗原量过剩时,不出现可见反应。 （三）可逆性（reversibility） （四）阶段性 三、影响抗原抗体反应的因素 （二）酸碱度 Ag、Ab多为蛋白质，具两性电离特性，有固定的等电点， pH过高或过低均可影响Ag、Ab反应一般：pH6～8为宜。 注意： 自凝——即pH达到或接近抗原的pI时，引起的抗原非特异性自身凝集现象。 酸凝——pH过低时造成的蛋白质自凝现象。 （三）温度—影响反应速度 免疫学检测技术的评价标准 Specificity（特异）： 检测信号针对性和排他性 Sensitivity（灵敏）： 可测出的最低含量 Simplicity（简便）： 操作是否方便 Safety（安全）： 是否有污染，对操作者的伤害 Saving（节约）： 性能/价格比 一、凝集反应（Agglutination） 颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块称为凝集反应。 1、絮状沉淀试验 操作步骤： （1） 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。 （2） 各管加入一定浓度的适量抗血清。 （3） 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。 （4） 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，目前 多用以测定抗原抗体反应的最适比。 2、环状沉淀试验 操作步骤： （1） 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（5×50mm）底部，避免产生气泡。 （2） 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。 （3） 置沉淀管于室温下使其反应，1~5min内在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。 应用：主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。 （诊断炭疽的Ascoli实验、细菌分型、血迹鉴定）。 3、 凝胶扩散沉淀 凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的扩散部位相遇形成沉淀线的反应。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。 最常用的方法为： ①单向琼脂扩散试验 ②双向琼脂扩散试验 （1）单向琼脂扩散试验 （2）双向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散时，在两孔间可出现沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。 3、免疫电泳技术 免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。 两大优点： 一是加快了沉淀反应的速度 二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。 免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳、免疫印迹等 （1）血清免疫电泳 将抗原混合物在凝胶中用电泳分离后，沿电泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示病人血清与正常人血清存在的差异，即血清蛋白组分的缺少或增加。 （3）火箭免疫电泳 火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起来的一项定量技术，实质上是加速度的单向扩散。 （4）免疫印迹 western blot 免疫标记技术是采用酶、荧光素、放射性核素等标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反应。 免疫标记