免疫学实验技术课程.ppt

第九章 免疫学实验技术概述 血清学反应：体外发生的抗原抗体反应。 二、血清学反应的一般规律 (一)特异性 Ab只能与相应Ag特异结合。 Ag表面常具有多个(多种)不同表位，所以免疫血清中也应含有相应多种特异性Ab。 （二）交叉性 交叉抗原：不同的Ag物质之间存在相同的Ag表位时，称为交叉抗原。 交叉反应：用不同抗原制备的抗血清除与各自的相应Ag发生反应外，尚能与对方Ag发生反应。 通常两种Ag之间亲缘关系越近，交叉反应程度越高。 (三)用已知测未知 所有血清学反应都毫无例外地是用已知Ag测未知Ab或用已知Ab测未知Ag。 用已知测未知的依据：抗原抗体的反应是特异的。 正确理解实验原理或进行试验设计的关键是搞清楚什么是已知，什么是未知，谁是抗原身份，谁是抗体身份，谁是身兼两职的。 (四)试验与抑制试验 许多血清学试验可以被相应的Ag／Ab所抑制，即抑制反应现象的出现，抑制试验可以验证反应的特异性；还可使一些不易被检测的Ag(如简单半Ag)或Ab(如单价Ab)，得以检出。 (五)结合力与离解力 Ag，Ab的结合为弱能量的非共价健结合，其结合力决定于Ag表位与Ab的结合点之间所形成的非共价健的数量，性质和距离，包括4种力的作用： 1．范德华引力 此力与两种相互作用的分子或原子间的距离的7次方成反比，即二者越靠近其引力越大。此力能否最大限度发挥作用，关键在于分子的空间构型是否互补或互补程度如何。 2．静电引力(库伦引力)： 由相反电荷(NH2+与COO-）间力决定。此力与两相反电荷基团间距离平方成反比。 总之Ag-Ab结合不仅要求结构上互补，构型上适应，电荷上相反，方能结合，结合后，由亲水胶体→憎胶体，此时如果Ag·Ab复合物电荷相同，则同性相斥，仍分散于溶媒中，如果有适当浓度电介质存在，可消除电荷，从而促进其凝集或沉淀。 任何抗血清中均含高亲合力Ab和低亲合力Ab，上述亲合力在生理性pH离子强度中通常最大。 Ag-Ab结合的离解力，指Ag-Ab结合具有可逆性，因为Ag-Ab之间靠非共价结合，因此在一定条件下可使其解离。解离后的Ag-Ab仍保留其原有活性。 (六) 结合比例 Ag与Ab的结合常需适当比例才出现可见反应，在最适比例时反应最明显； 这种现象可以用“格子学说”来解释：Ab(1gG)为二价，Ag通常为多价，只有Ag，Ab结合形成大的复合物，肉眼才可见； 只有当Ag与Ab比例适当时，才能形成大的复合物，比例不适当，就只能形成小的复合物而抑制反应现象的出现，此所谓带现象； 前带现象：Ab过剩，Ag过少；稀释Ab、凝集反应常见； 后带现象：Ag过剩，Ab过少；稀释Ag、沉淀反应常见。 (七) 血清学反应的影响因素 1．电介质：生理盐水，缓冲盐水，少数动物(禽)血清用8.5％NaCl； 2．温度； 3．pH：pH6.0～8.0 三、血清学技术的优越性 (一)检样量少，预处理简单： 一滴血清/血、一根羽毛、少许组织悬液等。 (二)种类多，可择优选用 (三) 方法简便快速 (四) 特异性、敏感性 (五) Ag/Ab定位、定量 四、血清学试验的制定原则 制定特定的或建立新的血清学方法时，应注意以下原则： (一) Ag准备和提纯 1．购自试剂公司：如半Ag、激素、酶、农药、抗生素、昂贵的天然Ag等。 2．自制：一般天然Ag、动物血清、组织Ag等， (二) Ab制备提纯 1．颗粒性Ag，递增3～4次、间隔一周 可溶性Ag，加佐剂 2．提纯：用作标准、致敏或特殊用途 (三)操作程序制定 (四)材料准备和滴定：工作浓度滴量 (五)试验条件选择：T、离子强度、 pH、时间等 (六)特异性试验 1．Ag、Ab验证：反复、重复验证 2．交叉试验 3．抑制试验(阻断) (七)敏感性试验 最小检测量或最小反应灵敏度 (八)重复性试验：该试验是结果可信度和试验标准化程度的重要指标之一。每批材料对每份样品至少做四个重复。计算批内变异系数。不同批的材料，应对同样样本进行复试，计算批间变异系数。 (九)稳定性试验 提供商品试剂盒所必须 五、血清学试验的应用 (一) 血清学诊断 (二) 生物活性物质超微定量 (三) Ag/Ab亚细胞、细胞水平定位 (四) Ag组分分析，如病毒结构蛋白可用免疫转印，免疫沉淀(琼扩、电泳、交叉免疫电泳等) (五) 物种鉴定分型 六、血清学试验的类型