利福霉素分离提取生产工艺剖析.ppt

利福霉素分离提取生产工艺 高虹婧 董是言 * 生物物质的分离（Bioseparation）是生物工程的一个重要部分。国外文献中，常称之为下游过程（Downstream Process），国内则称之为产品的分离或回收。 目的：把生物反应液，如发酵液或酶反应液内的有用物质分离出来，获得所需的目标产品。 下游加工过程的工艺过程决定于产品性质和要求达到的纯度。 微生物药物由于没有适当的提取方法或因提取收率太低，成本过高而不能投产的情况是很多的。 下游加工特点： 难度大 微生物的发酵液是复杂的多相系统，含有菌丝、未用完的培养基、生产菌的其它代谢产物，还有的是在发酵液预处理过程中加入的物质（如草酸、硫酸锌、黄血盐等）。其中生物活性物质的浓度通常很低，而杂质含量却很高，而且某些杂质与生物活性物质具有非常相似的化学结构和理化性质。此外，生物活性物质通常很不稳定，遇热或某些化学试剂会引起失活或分解，某些产品还要求无菌操作。 收率低 发酵液体积大，生物活性物质浓度低，最后成品要求达到的纯度又高，因此常常需要好几步操作（假如包含6步操作，每步收率可达90%，总收率也只有53%），在操作中减少精制步骤是非常重要的。 具有一定灵活性（不确定性） 因发酵是分批操作，与化学合成相比，具有生物变异性大，各批发酵液不尽相同的特点。特别是对染菌的批号也要能处理。 下游加工过程可分为3个阶段： 发酵液预处理和固—液分离； 初步纯化（提取）； 高度纯化（精制）。 发酵液 → 预处理 → 初步纯化 → 高度纯化 → 成品 利福霉素（Rifamycins） ：是1957年从地中海链霉菌(Streptomyces mediterranoi)的代谢产物中分离提取的复合物利福霉素B，继而又分离出A，B，C，D，E等。1962年，利福霉素B经化学转化为利福霉素SV，并被最先用于临床。由于其口服吸收不佳，故从3-甲酰利福霉素SV的多个衍生物中又筛选得到甲哌利福霉素，即利福平。该品可口服给药，而且疗效好，但易使菌株产生耐药性，有效时间短，对艾滋病并发症中的鸟复合分枝杆菌(MAC)感染活性较低，毒性较大。 利福霉素类药物有：利福霉素B二乙酰胺、利福平等。目前在临床应用的有利福平、利福喷汀及利福布汀。 结核病是由结核分枝杆菌感染而引起的慢性传染病，对人类的危害有数千年历史，是全球关注的公共卫生问题和社会问题。目前，化学药物 治疗是人类控制结核病的主要手段。1944年，链霉素、对氨基水杨酸等成为第一代首选抗结核药。自20世纪60年代利福平和乙胺丁醇成为首选抗结核药物以来，利福霉素类衍生物便在抗结核药物中占据了重要地位，为结核病的治疗做出了巨大贡献。 利福霉素类药物的母核结构(图1)为一个有27个碳原子的大环内酰胺，环中含有一个萘核。萘环上，由一脂肪链分别与C-2和C-12的C 原子相连接，构成“安莎桥” 结构，故也被归入安莎霉素类抗生素。 立体结构如图2所示，C-15位羰基以酰胺键与萘核相连，使脂肪链与萘核呈71°角，这保证了这个结构的几何稳定性。 利福霉素的作用机制主要有2方面： 一方面通过与细菌的DNA依赖性RNA聚合酶(DDRP)的β-亚单位 结合，抑制细菌RNA合成的起始阶段，阻碍mRNA的合成。从DNA合成RNA是细菌遗传转录的第一阶段，RNA聚合酶通过键合在一段DNA束的特定序列上催化转录过程。 另一方面，因为所有利福霉素衍生物都具有相同的母核，所以大多数该类化合物都能抑制DNA转录RNA，其表现出的抗菌活性差异主要是因为各衍生物透过细胞壁的能力不同所致。 例如：利福霉素B对分离的DNA聚合酶有良好的抑制作用，但因为其不能透过细胞壁，所以实际上抗菌活性较弱。 利福霉素B的分离提取 利福霉素S钠盐的分离提取 利福霉素O的分离提取 利福霉素 B 是利福霉素发酵产品中的主要产物，也是多种利福霉素类衍生物的重要合成原料。 目 前 国 内 利 福 霉 素 SV的 发 酵 水 平 约 为7000μg /ml，发酵 生 产 利福 霉 素 B 的 效 价可 达 到20000μg /ml 。 分离提取具体方法和流程 利福霉素B的分离提取——萃取法 提取流程： 放罐后的发酵液先加入ZnSO4溶液进行絮凝处理，过滤。滤液中加入萃取剂乙酸丁酯，搅拌下逐渐加入稀硫酸调节滤液pH值至终点为2.0~2.5，停止加酸，充分搅拌，静置分层，萃取。用pH7.5~8.0缓冲液进行三级错流反萃，加入萃取剂乙酸乙酯，搅拌下逐渐加入稀硫酸调节滤液pH值至终点为2.0~2.5，停止加酸，充分搅拌，静置分层，第二次萃取，浓缩，结晶，得到产物。 不同pH萃取相对利福霉素B提取的影响 由于利福霉素B为弱酸性，当利福霉素B以酸形式（RCOOH）存在时，极性