凝胶柱层析分离丙种球蛋白与核黄素课程.ppt

凝胶柱层析法分离丙种球蛋白与核黄素 制作人：第三组 陈文 顾香君 陈科亦 戴逊 桑圣月 冯伊鹭 一、简介 二、层析技术的原理 三、层析 四、实验器材 五、实验步骤 六、注意事项 简介 核黄素：维生素B2，又称核黄素，维他命B2。分子式C17H20N4O6。作为维生素B族的成员之一，核黄素水溶性较低，但在碱性溶液中容易溶解，在强酸溶液中稳定，光照及紫外照射引起不可逆的分解。可溶于氯化钠溶液，维生素B2是机体中许多酶系统的重要辅基的组成成分，参与物质和能量代谢。核黄素在机体中有递氢的作用，并是机体中一些重要的氧化还原酶的辅酶。 丙种球蛋白：按其来源不同可分为两种，一种是从健康人静脉血中提取制成的人血丙种球蛋白，另一种是从健康人胎盘血中提取制成的人胎盘血丙种球蛋白。二者作用相同，后者价格低于前者，且用量多于前者，但目前已停产。有些人盲目地、错误地认为丙种球蛋白是营养药、是补针，于是不管病情轻重、有病无病地滥用，结果会导致不良反应 层 析 固定相(Stationary phase ) ：是色谱的基质，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。 流动相(Mobile phase ) ：在色谱分离过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等。 层析的分类 （一）按两相所处的状态分类 层析的分类 （二）按操作方式分类 层析的分类 柱层析（column chromatography） 将固定相装在层析柱中，使样品朝着一个方向移动，通过各组分随流动相流动而得到分离的方法。 凝胶层析 (分子筛过滤、排阻层析) 混合物随流动相经固定相(网状孔径)的层析柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。 固定相（凝胶） 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的高分子聚合物，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致。 二、凝胶层析的原理 比孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，首先流出。 较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内部，然后再扩散出来，经历的流程长，流动速度慢，后流出。 三、试剂、器材： 3.1 层析介质：Sephadex G-50； 3.2 样品（包含2个组分）：　　　　　　　　　　　　　①核黄素（黄色）， ②丙种球蛋白， 　上样量：0.5ml/柱。 3.3 洗脱液： 0.1mol/L,Ph7.2的磷酸盐缓冲液（PBS） 3.4 层析柱、分光光度计等。 　　　　　　 四、实验步骤 四、实验步骤 （一）凝胶的准备 称取Sephadex G-50 3g，置于锥形瓶中，加PBS约50ml，在沸水浴中加热2h溶胀凝胶，用PBS漂洗，去除飘浮的细小颗粒，冷却到室温后再装柱。 （二）装柱 1. 取层析柱，洗净，检查出口；将层析柱固定在支架上，调整层析柱与水平面垂直。 2. 关层析柱出口，先用约10ml PBS预洗柱子，放出洗液；再加PBS至2cm高，然后关闭层析柱的出口。 3. 将凝胶悬液（约40ml）沿玻璃棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉积2cm高时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶沉积约8cm的高度即可，关闭出口（要求凝胶床无气泡、无断层、表面平整）。 4. 新柱装好后，加3-5倍体积PBS流过柱床，然后平衡10min。（注意：始终层析柱与水平面垂直） （三）上样 1. 先将柱的出口打开，让PBS逐渐流出，待液面与凝胶床面平齐时，关闭出口（注意：不可使凝胶柱表面干涸）。 2. 用刻度吸管取样品混合液0.5ml，沿管壁小心加于柱床表面，打开层析柱出口端，待样品完全渗入胶内，开始收集流出液，同时小心加洗脱液（PBS）， 控制流速：1滴/5-6秒。（注意柱床上要不断加PBS，保持1cm高水层） （四）洗脱、收集与检测 五、实验注意事项 装柱时需保持柱体垂直于水平面，不可随意晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。 加样时吸管伸入柱内，接近液面处沿管壁加入，动作要轻柔，不要将床面冲起。 实验过程中需密切注意保持层析柱中的凝胶始终处于PBS中，防止PBS排空。 * 由于各组分所受固定相的阻力和流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，使各组分得到分离。 本实验中用Sephadex G 50（分离分子量范围1500~20000），以蒸馏水为洗脱剂（流动