课31血红蛋白的提取与分离剖析.ppt

1、速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果。 问： 1、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间离心？ 2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？ 3、用质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤， 能否用蒸馏水或浓度高的氯化钠溶液？为什么？ 1、红细胞的洗涤 2、重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 实验操作 （一）样品处理 红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500 r／rain离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水(质量分数为0.9％的NaCl溶液)，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 1.红细胞的洗涤 实验操作 （一）样品处理 2.血红蛋白的释放 血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。 说出：蒸馏水和甲苯的作用。 实验操作 （一）样品处理 3.分离血红蛋白溶液 分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000 r／min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的溶液分为4层。从上往下数，第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 问： 1、采用什么方法分离血红蛋白？ 2、离心分层后，各层的成分各是什么？ 3、用滤纸过滤，去掉什么成分？ 实验操作 （一）样品处理 取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。 4.透析 问：透析过程及透析目的？ 透析目的是：除去样品中分子量较小的杂质。 说明：透析袋是一种半透膜，能使小分子自由进出，而大分 子不能通过。 思考：根据材料进行实验设计：现有烧杯一只、透析袋一个、碘液、淀粉溶液、铁架台一个、棉线若干。探究碘液、淀粉是否能通过透析袋。写出实验步骤和结果预测。 实验操作 （一）样品处理 4.透析 实验操作 （一）样品处理 阅读课本相关内容，了解凝胶色谱的操作过程。 实验操作 （二）凝胶色谱操作 实验操作 （二）凝胶色谱操作 1.凝胶色谱柱的制作 取长40 cm，内径为l.6 cm的玻璃管，两端磨平。柱底部的制作方法如下(图5-19)。首先选择适合封堵玻璃管口的橡皮塞，中间打孔，孔径大小要能够紧密插入0.5 mL的移液管。将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴，将0.5mL的移液管头部切下5 cm长的一段，插入橡皮塞孔内，插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面。将尼龙网剪成与橡皮塞上部一样大小的圆片，覆盖在橡皮塞的凹穴上，再用大小合适的l00目的尼龙纱将橡皮塞上部包好，插到玻璃管的一端。在色谱柱下端用移液管头部作出口部位，连接一细的尼龙管，并用螺旋夹控制尼龙管的打开与关闭，尼龙管的另一一端放人收集色谱流出液的收集器内。柱顶部的制作只需在色谱柱的另一端插入安装厂玻璃管的橡皮塞即可。 打孔-挖穴-安管-覆网-纱包-插管 注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 * 生产和生活中使用酶制剂和固定化酶，都需要把从微生物细胞中提取分离出来。 细胞中有许多种蛋白质，怎样才能将所需要的酶提取分离出来呢？ 2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组时代。 人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息。 蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究 内江二中生物教研组 课题 3 血红蛋白的提取和分离 课题背景 蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作。 血红蛋白是人和其他脊椎动物