生物检测技术(多抗和单抗)重点.ppt

HAT选择作用： 淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡； 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断;HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻。 杂交瘤细胞： 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息； 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力； 利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA, 可长期生长繁殖； 随机融合后的细胞类型 细胞组合 HGPRT 生长状态 淋巴细胞 + 骨髓瘤 + 长期生长 淋巴细胞 + 淋巴细胞 + 短期生长 骨髓瘤 + 骨髓瘤 — 不能生长 未融合淋巴细胞 + 短期生长 未融合骨髓瘤 — 不能生长 有限稀释法(limiting dilution) 显微操作法(micromanipulation) FACS法（fluorescence activated cell sorter） 软琼脂平板法(soft agar method) 阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存 特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞 有限稀释法 配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液(30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液，10%DMSO ) “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮? “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏 杂交瘤细胞的冻存与复苏 防止污染 避免染色体丢失 防止非分泌细胞的过度生长 防止细胞密度过高而死亡 细胞冷冻的意义 单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。 单克隆抗体的生产 动物体内诱生方法： 每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只 体外培养法： 中空纤维培养系统? 单抗含量不高，牛血清Ab难以去除 腹腔注射法 前5天进行,预先腹腔注射pristane （1～5）×106细胞1～3w形成腹水 多头加样枪 Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示? 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞?争抑制法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot 单克隆抗体的性质鉴定 可溶性抗原：ELISA抗体捕获法 细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞） 单克隆抗体的鉴定 ELISA McAb的特点： 高度特异性 高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 对环境敏感性 优点 ： 在体外“永久”地存活并传代，可用相对不纯的抗原制备； 局限性 ： 制备技术复杂、费时费工、价格较高； McAb PcAb 抗原要求 可以不纯 纯度高 得量 高 低 特异性 高 低 　　 稳定 　　低 高 沉淀反应 无 有 成本 高 低 McAb与PcAb的比较 1.医学检验试剂： ①传染病的快速诊断 ②寻找TSA及检测TAA ③免疫细胞抗原检测 ④激素测定 ⑤血中药物浓度监测 ⑥HLA分型监测 2.导向治疗作用 3.抗原物质的分离和提纯 * 4、亲和层析法 原理 利用蛋白质之间的特异性结合 （抗体-抗原，受体-配体） 将一种配基与凝胶颗