生化20重组DNA技术重点.ppt

* * * * * * * * * * 1. 质粒 (plasmid)载体 细菌培养 质粒扩增并表达蛋白质 大肠杆菌 染色质 质粒 细菌染色质以外的双链环状DNA， 能自我复制和表达其携带的遗传信息。 Ampr ORI Tetr pBR322质粒：一种克隆质粒 ORI：复制起始点， 保证高拷贝自我复制。 结构与功能： Ampr, Tetr： 两个抗性基因用于 筛选阳性克隆。 Pst I, BamH I： 两个单酶切位点用于插入目的基因 分子量较小 拷贝数较高 pUC18/pUC19 pUC19 2686 bp Ampr Lac Z P(BLA) Plac Ori Ava I (413) Bam HI (418) Eco RI (397) Hin dIII (448) Pst I (440) Sma I (415) Xma I (413) Apa LI (178) Apa LI (1121) Apa LI (2367) MCS MCS：Multiple Clonning Site 提供多个单酶切位点用于克隆操作 LacZ: 蓝白斑筛选阳性克隆 第四节 目的基因的获得和体外重组 一、目的基因的获得 ----分 二、目的基因的体外重组 ----切、接 目的基因 (target DNA) cDNA (complementary DNA) 基因组DNA (genomic DNA) 目的: 分离获得某一感兴趣的基因或DNA序列 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 种类： （一） 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产 物的氨基酸序列 （二）聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) （三）从基因文库中筛选 （一）目的基因的获取—分 * 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 组织或细胞染色体DNA 基因片段 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 * 从基因组DNA文库获取目的基因 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 * 从cDNA文库获取目的基因 反转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 基因组文库：G-文库 cDNA文库：c-文库 (常用) 方法： 基因文库 用目的基因上的一段 DNA做成探针与文库中的 DNA作核酸杂交，从基因 文库中“钓出”有目的基 因的克隆。 （三）外源基因与载体的连接—接 1. 黏性末端连接 方式：(1) 同一限制酶切位点连接 (2) 不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 （二）克隆载体的选择和构建 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 目的基因自连 载体自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 2. 平末端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的粘端补齐或切平形成的平端 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 3. 人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生黏性末端，而进行粘端连接。 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 目 录 4. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出黏性末端，再进行粘端连接。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 5′ 5′ 3′ 3′ 5′