生物药物的分离纯化重点.ppt

第二讲 生物药物的分离纯化 主要讲授内容 1.生物药物原料的选择、预处理与保存方法 2. 生物药物的提取 3. 蛋白质类药物的分离纯化方法 4. 核酸类药物的分离纯化方法 5. 糖类药物的分离纯化方法 6. 脂类药物的分离纯化方法 7. 氨基酸类药物的分离纯化方法 1.1 生物药物原料的选择 生物药物生产原料的选择原则主要是：(1) 有效成分含量高，原料新鲜；(2)原料来源丰富，易得，原料产地较近；(3)原料中杂质含量少；(4)原料成本低等。但是，同时具备这4种有利因素的原料不多，生产研究者可酌情选择，但第一条是最重要的。 原料的选择还要注意如下事项：植物原料要注意植物生长的季节性，选择最佳采集时间；微生物原料要注意微生物生长的对数期长短；动物原料有的要注意动物的类别、年龄与性别。 也应注意原料的采集地和批次。 1.2 原料的预处理与保存 动物原料采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存；植物原料确定后，要择时采集并就地除去没有用的部分，将有用部分保鲜处理；收集微生物原料时，要及时将菌体细胞与培养液分开，进行保鲜处理。 原料的保存方法主要有：①冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用-40℃速冻。②有机溶剂脱水法。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。③防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。 2. 生物药物的提取 (1) 生物组织与细胞的破碎 (2) 生物组织细胞破碎后立即进行提取 生物组织与细胞的破碎 生物药物大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，对生物组织与细胞的破碎过程是非常重要的。 常用的破碎方法有5种： A. 磨切法，该法属于机械破碎方法，使用的设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等。 B. 压力法，这类方法有加压与减压两种，常用的法兰西压釜使用效果良好。 C. 反复冻融法，该方法设备简便，活性保持好，但用时较长。 D.超声波振荡破碎法，该方法破碎效果较好，但由于局部发热，对活性有损失。 E. 自溶法或酶解法，用得较少。 生物组织活性物质的提取要在细胞破碎后立即进行。 提取过程中 （1）要根据活性物质的性质，选择提取试剂。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂(如氯仿、丙酮等)。 （2）考虑提取溶剂的用量（料液比）及提取次数、提取时间。 （3）注意提取的温度、pH、变性剂等因素。这样才可以保证活性物质提取充分而且不变性。 3. 蛋白质类药物的分离纯化方法 蛋白质类药物主要包括蛋白质、多肽和酶类等药物。它们的分离纯化方法有： (1) 沉淀法 (2) 按分子大小分离的方法 (3) 按分子所带电荷进行分离的方法 (4) 亲和层析法 (1) 沉淀法 蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。该法的原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、与靶物质结合沉淀法(如抗体一抗原)等。 (2) 按分子大小分离的方法 这类方法有超滤法和透析法(即膜分离方法)、凝胶层析法、超速离心法等。其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。 (3) 按分子所带电荷进行分离的方法 氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它们具有等电点，在离开等电点的pH时便会带正或负电荷。例如某蛋白质等电点为7.0，当溶液pH为4.0时，分子则带有正电荷。由于具有该性质，利用带电性质进行分离是极其有效的方法。 利用蛋白质带电性质行分离的方法有： 离子交换柱层析法； 电泳法； 等电聚焦法。 （4）亲和层析法 大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物(或抑制剂)、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。 亲和层析法主要包括：疏水反应层析、金属螯合层析、免疫亲和层析、共价亲和层析、固定化染料亲和层析、特殊基团亲和层析等。亲和层析技术大量应用于蛋白质分离和纯化。 4. 核酸类药物的分离纯化方法 核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法。 提取法生产DNA和RNA的主要技术是，先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离RNA与DNA。 发酵法主要用于生产单核苷酸。 5．糖类药物的分离纯化方法 由于各种糖类药物的性质和原料来源不同，没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只介绍多糖和粘多糖的一般分离纯化方法。 提取方法 非降解法：适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。 降解法：适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖。例如从软骨中分离提取硫酸软骨素，就是用碱处理进行降解