生物药物分析与检验第三章免疫分析法重点.ppt

* 沉淀线靠近抗原孔，提示抗体含量高；靠近抗体孔，提示抗原含量高。出现多条沉淀线，则说明抗原和抗体都不是单一成分。沉淀线弯向分子量大的一边，如相等，则为直线。抗体多为IgG，分子量约150000，据此可粗略估计未知抗原的分子量。两种受检抗原的性质可完全相同，部分相同或完全不同。 * 表7-3 SM-EDA-GA包被法中链霉素包被质量浓度对ELISA实验误差的影响 包被质量浓度（mg/ml） ELISA测定结果（A492±SD）（n=4） 4 1.098±0.0628 1* 1.011±0.0302 0.5 0.969±0.0876 0.25 0.792±0.1023 3、酶-底物反应时间的选择 抗原与抗体、抗体与酶标抗体反应一般在37℃反应2～3h达到高峰。 时间太短，敏感性下降，时间太长，吸附的抗原或复合物（在这个温度下）可能脱落。 酶-底物反应时间一般采用15min、30min或45min，也可以标准阳性血清为准，随时测定其OD值，当达到规定的OD值时，即终止反应。 四、ELISA的定量计算与灵敏度 1、ELISA的定量计算 一般采用分光光度计测定结合物中的酶量和抗体蛋白（IgG）量，酶量和IgG计算方法如下。 其中，0.4表示酶的A403nm值为1时，酶量为0.4mg/ml；0.42表示酶的A403nm值为1时，其相应A280nm值为0.42；0.62表示在A280nm值为1时，IgG量为0.62mg/ml；0.94表示酶、戊二醛结合后，A280nm增加约6％。 酶结合物中结合的酶量、酶结合率计算方法： 以采用过碘酸钠氧化法进行酶联为例，摩尔比值计算方法： 酶量为1mg/ml，摩尔比值为1.5～2.0，酶结合率在30%以上时，可获得较好的ELISA分析结果。 2、ELISA的灵敏度与ELISA放大系统 （1）ELISA的灵敏度 ELISA的检出限已经达到10-8～10-12g，但对某些测定仍需更高的灵敏度。 传统ELISA中显色剂发色团的吸光度是限制ELISA灵敏度的主要因素。 改用荧光标记或其他化学发光物标记抗体替代酶标记抗体可以提高灵敏度。 改变传统ELISA的操作程序也可以提高灵敏度，如SIMIT技术。 采用放大系统是提高ELISA灵敏度的主要途径。 （2）ELISA放大系统 ①生物素-亲和素放大系统可增加抗体（或抗原）的标记率。 生物素与亲和素结合速率较快且结合物的稳定性高（K=1015），不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。 生物素对抗体和酶的标记率高（10个生物素分子/抗体分子），且生物素分子易于活化，标记后不影响抗体和酶的活性。 每个亲和素分子能结合4个生物素，因而可偶联更多的联结生物素的酶分子，从而提高ELISA的敏感性。 生物素-亲和素标记体系有灵活多变的运用方式，可以适应不同的分析设计。 ②微粒放大。用适当的微粒代替酶-抗体结合物也可以获得放大效果。 每个微粒表面可以同时结合大量记酶和抗体分子。在包含微粒放大的夹心ELISA法中，微粒通过结合于其上的第二抗体结合于抗原。微粒上又结合着标记酶，其数量远比第二抗体能结合的标记酶多，因此得以放大。 例如，微颗粒放大系统用微颗粒硅胶（直径约40nm）作为中间体连接酶和抗体，避免酶和抗体直接连接。酶微颗粒硅胶可连接上千个酶分子，可使体系增敏，已用于测定甲胎蛋白，灵敏度放大两个数量级。 五、ELISA法的应用 酶免疫测定具有高度的特异性和敏感性，几乎所有的可溶性抗原-抗体系统均可用以检测，它的最小可测值达ng甚至pg水平。 酶免疫测定在各应用领域中的普及，应归功于商品试剂盒和自动或半自动检测仪器的问世。 目前应用较广的酶免疫检测项目一般有试剂盒出售。 完整的ELISA试剂盒应包含包被好的固相载体、酶结合物、底物和各种浓缩的稀释液、缓冲液等。 这些试剂在冰箱中可保存半年以上，因此实验室中只需要用蒸馏水稀释全套试剂即可。 六、微量致敏性杂质青霉噻唑蛋白的测定 基因工程药品在生产过程中为防止污染，在细胞培养或发酵过程中常需加入一定量的青霉素。 青霉素在水溶液中很容易和蛋白质结合形成过敏性杂质青霉噻唑（benzyl penicilloyl，BPO）蛋白，为确保基因工程药品的产品质量，可以用ELISA对基因工程药品中是否残存有青霉噻唑蛋白进行检测，其对样品中结合青霉素的绝对检出量小于0.3×10-6。 其实验步骤如下： （1）包被：用碳酸缓冲液（0.1mol/L，pH 9.6）直接包被待测抗原，200μL/孔； 包被BPO4-CY作为阳性对照，并设有包被抗原不加抗BPO血清和不包被抗原但加抗BPO血清两组阴性对照； 此外，实验中还设有待测抗原-BSA抗血清相互作用组作为阴性血清对照；4℃冰箱过夜。 （2）用洗涤液（BPS 0.01mol/L，pH 7.2）