生化实验--质粒DNA提取重点.ppt

SDS：是一种离子型表面活性剂，其主要功能是溶解细胞膜上的脂质和蛋白质，因而溶解膜蛋白，破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；SDS能与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来，为后续处理需要。 注意： 1、处理时间不能过长；否则碱性条件下基因组DNA会慢慢断裂 2、温柔混合；避免机械剪切导致已经变性的基因组DNA断裂 SDS:十二烷基硫酸钠 溶液3：是大部分蛋白质和细菌基因组DNA沉淀 溶液3（PH=4.8）：0.5M 60ml KAC 11.5ml冰醋酸 28.5ml 水 本质上是KAC-HAC的缓冲液；用PH=4.8的溶液3是为了把强碱性的提取液调回至PH中性，使变性的质粒DNA能够复性并稳定存在 KAC：SDS能与蛋白质结合，SDS能与KAC生产PDS，PDS的溶解度要比SDS低得多，从而使大部分的蛋白质与细菌基因组DNA一起沉淀，使沉淀更完全。另外可以中和核酸上的电荷，减小相斥力，有利于变性的大分子染色体DNA、RNA互相聚合而沉淀下来。 为何加入溶液3之后出现大量的沉淀？这沉淀的本质是什么？ 这里还需把SDS除掉的原因是？ 酚/氯仿/（异丙醇）：抽提去除蛋白 酚：使蛋白质变性 氯仿：水饱和酚比重略比水重，遇到高浓度盐，离心后酚想转移至上层，不利于含质粒水相的回收，加入氯仿可增重其比重，使酚-氯仿始终在下层，另外避免酚进入水相。 异丙醇：让离心后上下层的界面更清晰，方便水相的回收 为何不加氯仿，酚会大量进入水相？ 无水乙醇：沉淀质粒DNA 乙醇可以任意比例和水相混溶，乙醇和核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的DNA沉淀剂 DNA溶液中DNA是以水和状态稳定存在的，当加入乙醇的时候，乙醇会夺取DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合 RNaseA：使RNA降解，减少提取得到的质粒DNA中的RNA，以便减少对后续实验的影响。 为何要用无水乙醇,加入两倍体积无水乙醇后，乙醇含量就变为了67%, ，用95%的乙醇可不可以，无水乙醇的价格要比95%的乙醇价格要贵得多 实验步骤 1、 细菌培养： 将含有pQE30质粒的大肠埃希菌接种到TG1 10 uL接种到10ml含氨苄西林(100 μg /mL)的LB培养液中， 37℃摇培过夜(10-12h). 2、收集菌体： 取1.5 mL菌液转入离心管中 ↓ 10000 rpm，1min 弃上清。将离心管倒置于纸巾上，以尽量去除上清 3. 悬浮细菌： 将细菌沉淀重悬于100ul用冰预冷的溶液p1中，涡旋震荡，彻底悬浮细菌沉淀。注意：细胞悬液必须悬浮均匀，无可见沉淀块，否则所提质粒DNA的纯度及所得率会大大降低。 4. 碱液裂解细菌： 加200 uL新配制的溶液P2，立即轻柔颠倒离心管6-8次。使管内内容物混匀，禁止剧烈振荡。置冰浴中放置2min。 5. 中和与复性： 加150 uL用冰预冷的溶液P3，立即温和颠倒离心管数次。，使溶液p3在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后置冰浴中5min 6.离心沉淀： ↓ 12000 rpm, 5min 将含质粒DNA的上清转移到另一离心管中 7. 去蛋白： 加等体积酚-氯仿，剧烈振荡混匀，静置3min待其分层后， ↓ 12000 rpm, 10 min，将上层液体转入到另外一离心管中 8、 乙醇沉淀质粒DNA： 加入2倍体积的无水乙醇，震荡混合，静置5min使质粒DNA形成沉淀。 ↓ 12000rpm, 10 min, 收集质粒DNA沉淀，弃上清液 为何要2倍体积的无水乙醇 9.乙醇洗盐: 质粒DNA沉淀里有一定量的盐分需要除去。加入1ml 70%乙醇，轻缓摇动数次， ↓ 12000rpm, 2 min, 弃上清液 10.溶解质粒DNA： 待残余乙醇挥发干净后，加30 ul TE缓冲液(PH 8.0） 溶解沉淀，加2 ul RaseA(10 mg/ml),37度保温30min以去除RNA。所得质粒粒DNA置-20度保存备用。 实验是不是还有缺陷，其中RNseA怎么除掉 为何要加TE缓冲液，有什么好处？ DNA的保存 1、短期贮存：4℃或-20℃存放于TE缓冲液中。TE缓冲液的pH与DNA贮存有关，pH=8, 可减少DNA脱氨反应，pH7.0, DNA容易变性。 2、长期贮存：-70℃存置于TE缓冲液中, 在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。 注意: 小心操作移液器，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA (包括质粒