生化试验设计重点.ppt

生化设计实验 设计实验人员： 赵乐，王康华，王凯，孔景浩,许瑶，王轩，王硕 实验原理——血红蛋白概况 血红蛋白是红细胞的主要成分，在正常情况下，每个红细胞均含有一定量的血红蛋白。血红蛋白是由珠蛋白和亚铁血红素组成的结合蛋白质。血红蛋白除能与氧结合形成氧合血红蛋白外，还能与某些物质作用形成多种血红蛋白衍生物。它们具有特定的色泽和吸光谱，在临床上，可用以诊断某些变性血红蛋白血症和血红蛋白的定量测定。 实验原理——基本原理 根据蛋白质各种特性的差异，如蛋白质的理化性质、形状、大小、电荷性质和多少、吸附性质、亲和力、溶解度等等，可以用来分离不同种类的蛋白质 实验步骤——样品处理 b、血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟。 实验步骤——样品处理 c、离心：将搅拌好的混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10分钟，试管中的溶液会分为四层：最上层为无色透明的甲苯层；中上层为白色薄层固体的脂溶性物质的沉淀层；中下层为红色透明的血红蛋白的水溶液层；最下层为暗红色其他杂质的沉淀层。 实验步骤——样品处理 d、分离血红蛋白溶液：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，在分液漏斗中静置片刻后，分离出下层红色透明液体。 粗分离 取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，pH为7.0，透析12小时，目的是除去样品中分子量较小的杂质或用于更换样品中的缓冲液。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。 纯化 a、凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。（注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。）④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。 b、凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择：材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 ③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 c、样品加入与洗脱： ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） ⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 鉴定（SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳） 1，安装垂直板电泳装置 鉴定（SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳） 鉴定（SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳） 4，电泳 + 染色 + 脱色 鉴定（SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳） 5，分析 血红蛋白含量的测定 用滴管加0.1mol/L HCl于血红蛋白稀释管内，到刻度10处。用刺血针刺破指尖采血，血滴宜大些。用血红蛋白吸管的尖端接触血滴，吸血至刻度20ul处（0.02ml）。用滤纸片或棉球擦净吸管口周围的血液，将吸管插入血红蛋白稀释管的盐酸内，轻轻吹出血液至管底部，反复吸入并吹出稀释管内上层的盐酸，洗涤吸管多次，使吸管内的血液完全洗入稀释管内。摇匀或用小玻璃棒搅匀后，放置10min，使盐酸与血红蛋白充分作用。 把稀释管插入标准比色架两色柱中央的空格中，使无刻度的两侧面位于空格的前后方，便于透光和比色。 · 用滴管向稀释管内逐滴加入蒸馏水，边滴边搅拌边观察颜色，直至颜色与标准玻璃色柱相同为止。稀释管上液面的刻度读数即为每100ml血液血红蛋白的克数。 实验结果 血红蛋白参考值 成年男性：1.3—1.5g/L； 成年女性：1.1—1.4g/L ； 儿童：（依年龄而异）1.2—1.4