生物制药技术-第二章-基因工程制药(5,6,7,8,9)重点.pptx

---第五节，第六节，第七节，第八节，第九节;第五节 基因工程菌生长代谢的特点; 对菌体生长的调控主要有两种观点：一种观点认为能量的供应决定了菌体的最大比生长速率:另一种观点认为是小分子前体和催化组分(如RNA聚合酶，核糖体等)的限制决定了菌体的最大比生长速率。这两种观点分别从能量和合成反应的前体这两个不同的角度研究菌体的生长。; 一、菌体生长与能量的关系;高浓度的乙酸能明显地抑制菌体的生长。Konstantin等报道，发酵液中 乙酸的浓度大于15 g/L 时菌体生长停止。Luli等对不同菌株进行研究，发现它们对乙酸的耐受 程度有很大差别。在研究rIL-2工程菌K802(pLY-4)肘，发现乙酸的抑制作用是高密度培养时 限制菌体生长和表达的重要因素之一。培养基中存在4 g/L乙酸时，菌体比生长速率从不存在 乙酸时的0. 82/h 下降到0.17/h，rIL-2表达水平从63.4%下降到37. 7%。乙酸的抑制作用与培 养基的pH有关.适当提高pH能减少乙酸的抑制作用。; 分批培养中选用不同的碳源，补料培养中通过控制补料速度，连续培养中通过控制稀释速率等培养方法，都能在一定范围内控制菌体生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用，以实现 工程茵的高密度培养和提高重组产物的表达水平。Eppstein等培养大肠杆菌时，把溶氧突然回升10%以上作为判断培养基中营养缺乏的标志，来控制补糖速度，得到30 gDCW/L的菌密度。 Shiloach等采用补氨来控制pH.，根据补氨量确定补糖量的方法，培养大肠杆菌达35 gDCW I/L；Eppstein等采用相似的方案，并在后期结合富氧平培养的方法，培养大肠杆菌王111. 4 gDCW/L。 而Riesenberg根据尾气分析和其他分析参数，通过模型计算，使反馈控制补料速度维持比生长速率为0.11/h，培养大肠杆菌至110 gDCW/L。;这些培养方法的实质是控制菌体的糖酵解速度，使之低于TCA循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的产生。 这些方法都是以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌体生长速度为代价的。Han 等发现在基本培养基中补加酵母抽提物和甲硫氨酸都能减少乙酸的产生，他认为甲硫氨酸的作用是提高菌体的有氧代谢能力；而酵母抽提物的作用是比生长速率相同时，能使菌体减少葡萄糖的摄取，从而减少乙酸的产生。通过代i谢工程的方法提高菌体摄氧能力，改变呼吸链三羧酸循环的关键酶活性，关闭乙酸合成途径等都可以提高菌体的供氧能力，改变菌体的比生长速率和减少乙酸的产生等。Beiley报道，在大肠杆菌中克隆具有携带氧能力的VHB蛋白基因，以提高菌体的氧摄取能力，摇瓶试验发现带有VHB蛋白的大肠杆菌的比生长速率和菌密度都高于不带该基因的菌。Bauer采用磷酸乙航化酶缺陷株作为宿主菌，从而阻止了乙酰辅酶A转化为乙酸，减 少了乙酸的积累，使rIL-2的表达从8%提高到 17%。; 二、菌体生长和前体供应的关系;;;第六节基因工程菌的不稳定性;;质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。质粒自发缺失与质粒中短的正向重复序列之间的同源重组有关，具有两个串联启动子的质粒更容易发生缺失；在无同源性的两个位点之间也会发生缺失；培养条件也会对质粒结构不稳定性产生影响。 质粒稳定性的分析方法如下：将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂布于不含抗性标记抗生素的平板培养基。培养10~12h，然后随机挑选100个菌落接种到含抗性标记抗生素的平板培养基上，培养10~ 12 h，统计长出的菌落数。每一样品应取3次重复的结果，计算出比值，该比值反映了质粒的稳定性，称为稳定性(stability，ST)。;二、提高质粒稳定性的方法;2.选择合适的载体;3.选择压力;4.分阶段控制培养;5.控制培养条件;可调控的环境参数为培养基组分、战养温度、pH和溶解氧浓度等。某些基因重组菌在复合培养基中共有较高的质粒稳定性，含有机氮源如酵母抽提物、蛋白胀等营养丰富的复合培养基提供了生长必需的氨基酸和其他物质，微生物的生长较在基本培养基中快。在基本培养基中造成携带质粒的重组菌比例下降的主要原因是重组菌和宿主菌比生长速率的差异，而在复合培养基中则是由于比生长速率的差异以及质粒丢失的概率二者共同起作用。采用温度调控表达系统 时，将大肠杆菌的培养温度由 30 °C升到 42 °C，诱导外源基因基因表达的同时往往造成质粒的丢失。;;6.固定化; 第七节 基因工程菌中试; 一、工程菌选择; 二、反应器(发酵罐)设计; 三、发酵培养基组成; 四、工艺最佳化与参数监测控制 ; 2.参数监测控制;五、计算机的应用;第八节 重组工程菌的培养; 一、基因工程菌的培养方式;DO-Stat 方法; (2) Balanc