生物制药技术-第二章-基因工程制药(10,11小节)重点.pptx

第二章 基因工程制药;第十节基因工程药物的分离纯化;; 一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素 ; 2物料中杂质种类和性质; 3、目的产物特性; 4.产品质量要求;二、分离纯化的基本过程; 三、细胞的破碎方法;1.物理破碎法; (1)高压匀浆法; (2)高速珠磨法; (3 )超声破碎法; (4 )高压挤压法; 2.化学破碎法;(1)渗透冲击; (2)增溶法; (3)脂溶法; 3.生物破碎法;;; 四、固液分离;; 五、重组蛋白质的分离纯化;;; (一)离子交换层析; 1 、离子交换层析的基本原理;;;; ; 2.离子交换层析的基本操作; (1)离子交换剂的选择;;; (2)离子交换剂的预处理、再生和保存;;; (3)层析柱; (4)平衡缓冲液的选择;( 5)上样; (6)洗脱;; (7)样品的浓缩、脱盐; (二)疏水层析 ; 1.疏水层析的基本原理; 2.疏水层析介质;; 3影响疏水层析的因素;;;4.疏水层析的应用;; (三)亲和层析; 1.亲和层析的基本原理;2.亲和吸附剂;;3.配体;;;4. 基质的活化; 5.配体与基质的偶联;6.亲和层析的基本操作; (1)上样;; (2)洗脱;; (3)亲和吸附剂的再生和保存;㈣凝胶过滤层析;; 1.凝胶过滤层析的基本原理;; 2.凝胶层析的基本操作 ;分级分离则是指将一组相对 分子质量比较接近的组分分开，这时要根据样品组分的具体情况来选择凝胶。 一方面凝胶的分 离范围应包括所要分离的各组分的相对分子质量，另一 方面要合适，不能过大。分离范围过小， 某些组分得不到分离;分离范围过大，则分辨率低，分离效果不好。选择凝胶的另一因素是颗粒 的大小。颗粒小，分辨率高，但阻力大，流速低，时间长，有时反而会造成严重的扩散，不利于分 离。颗粒大，流速快，分辨率低，但若条件得当有时也可以得到满意的结果。在实验室通常多用 直径50~300μm(溶胀后的直径)的颗粒。; (2)凝胶的处理和保存; (3)层析柱的选择;对于分级分离，则要求柱床体积大 于样品体积25倍以上，甚至多达100倍，柱的直径与长度比为(1：100)~(1：25)，柱的长度A 般不超过100cm。为得到高分辨率，可将柱子串联使用。凝胶柱的装填质量将直接影响分离效 果，凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。有条件者可用如蓝色葡聚糖 -2000上柱，观察其在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。若色带狭窄、平整、均匀下降，表明柱中的凝胶装填质量好，可以使用;若色带弥散、歪曲，则需重新装柱。; (4)洗脱液的选择; (5)加样; (6)洗脱速度; 六、非蛋白质类杂质的去除; 2、热原质的去除; 传统的去除热原质的方法不适用于蛋白质生产。相对分子质量小的多钛或蛋白质中的热原 质可以用超滤或反渗透的方法去除， 但对大分子蛋白质无效。因为脂多糖是阴离子物质，可用阴 离子交换层析法去除，此时应调节pH使蛋白质不被吸附。脂多糖中脂质是疏水性的，因而也可 用疏水层析法除去。另外，还可用亲和层析法去除，配基可用多黏菌素B、变形细胞溶解物或广 谱的抗体。; 3病毒的去除; 七、选择分离纯化污法的依据; 周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达之间的一种形式，它可以避开细胞内可溶性 蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于分离纯化。为了获得周质蛋白，E. cοli经低浓度溶菌酶处理后般采用渗透压休克的方法来获得。由于周质中的蛋白仅有为数不多的几种 分泌蛋白，同时又无蛋白水解酶的污染，因此通常能够回收到高质量的产物。; 细胞内不溶性的表达产物包含体对蛋白质分离纯化有两方面的影响，一是它可以很容易地与胞内可溶性蛋白杂质分离，蛋白纯化较容易完成;另一方面产物经过了一个变性复性过 程，较易形成产物的错误折叠和聚合体。包含体可从匀浆液中以低速离心出来，以促溶剂，如尿 素、盐酸胍、十二烷基硫酸钠溶解，在适当条件下(pH、离子强度与稀释的环境)复性。包含体虽 然增加了提取的步骤，但也有优点，表现在包含体中目的蛋白质的纯度较高，可达20%~80%. 且不受蛋白酶的破坏。如果杂质的存在影响复性，也时以在纯化后再进行复性。; 2.根据分离单元之间的衔接选择;亲和层析选择性最强，但不能放在第一步。一方面因为杂质多，易受污染，使用寿命降低；另 一方面，体积较大，需用大量的介质，而亲和层析介质一般较贵。因此亲和层析多放在第二步以 后。有时为了防止介质中毒，在其前面加一保护柱，通常为不带配基的介质。经过亲和层析后. 还可能有脱落的配基存在，而且目的蛋白质在分离和纯化过程中会聚合成二聚体或更高的聚合 物，特别是当浓度较高，或含有降解产物时更易形成聚合体，因此最后需经过进一步纯化操作，通 常使用凝胶过滤色谱，也可用高效液相色谱法，但费用较高o凝胶过滤色谱放在最后一步又可以