生物制药技术-第四章-抗体制药(1,2,3)重点.pptx

第四章抗体制药;第一节 概 述; 因此，抗体是指能与相应抗原特异性综合的具有免疫功能的球蛋白。它是机体免疫系统受 抗原物质刺激后，B淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。20 世纪60年代初期.发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。患者血清中也出现 同抗体分子结构类似的球蛋白。因此，将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为 免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。 显然，Ig是化学结构上的概念，而抗体是生物学功能上的概 念。也就是说，所有抗体均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗体活性。由于病原微生物是含有 多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物.故称多克隆抗体， 即针 对多种抗原决定簇的抗体。这些抗体制剂在应用过程中经常发生非特异性交叉反应而出现假阳 性结果，必须经多次吸收试验才能得到所谓的精制单价血清，用于临床病原学诊断，如痢疾杆菌 属诊断血清和沙门氏菌属诊断血清等。虽然称为精制单价血清，但仍然难免出现假阳性结果;而且其产量很低.很难满足临床治疗和诊断上的需要。; 1975年Kohler和Milstein等人首次利用B 淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体( monoclonal antibody，McAb)。他们将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释 法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系.此细胞系能产生结构和特异性完全相同的高 纯度抗体。这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，故称为单 克隆抗体(图4-1)。单克隆抗体具有高度特异性、均一性，有稳定来源可大量生产等特点，为抗体 的制备和应用提供了全新的手段.促进了基础医学和临床医学等众多学科的发展。单克隆抗体作为抗体制剂，在临床实践中，主要用于疾病的诊断和治疗两个方面。如利用单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原辅助临床诊断，或用同位素标记单克隆抗体进行肿瘤显像做免疫定位诊断。; 单克隆抗体制剂也用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD的单克隆抗体，因其对器官移植排斥反应有显著的抑制效果，用作免疫抑制剂己在美国批准上市。以单克隆抗体作为载体的药物可对肿瘤进行定向治疗。;但是，临床应用的实践证明，免疫导向疗法并没有成功，其障碍有:;; 第二节单克隆抗体及真制备; 一、抗原与动物免疫; 因免疫功物品系和骨髓瘤细胞在种系发生I二距离越远，产生的杂交瘤越不稳定，故一般采用勺 骨髓瘤供体问一品系的动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB∕c小鼠和Lou大 鼠，因此免疫功物也多采用相应的品系，最常用的也是BALB/c小鼠。在选择动物时应苦虑到动J物 品系的免疫应答基因对抗原免疫应答的影响。如果BALB/c小鼠对所用抗原不能产生良好的 免疫应答时，应改用其他品系小鼠与大鼠。常用的骨髓瘤细胞系及其来源如表4-1 所示。 ; 免疫方法分为体内免疫法和体外免疫法。体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8~12周龄的雌性鼠。颗粒性抗原(如细菌、细胞抗原)的免疫原性强，可不加佐剂，直 接注入腹腔10个细胞进行初次免疫，间隙1~3周，再追加免疫1~2次。可溶性抗原则按每只 小鼠10~ 100μg抗原与弗氏完全佐剂等量混合后腹腔内注射，进行初次免疫，间隔2~4周，再 用不加佐剂的原抗原追加免疫1~2次。一般在采集牌细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，其 目的是使对应的B淋巴细胞克隆受到可靠的最大限度的剌激，使其迅速地增殖分裂，因为细胞 融合后增殖最好的细胞是迅速分裂的细胞。在免疫后第二天淋巴细胞的增殖率最高，由静脉注 射就是为了提高抗原浓度，刺激更多的B细胞。;; 二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择;;; 由于SP2∕0等骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤鸟瞟岭磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此脾-瘤融合的杂交瘤细 胞可利用HGPRT，用次黄瞟岭(H)和胸腺嘧啶(T)合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。选择 性培养的常规方法是将融合的细胞悬浮于HAT的培养液(表4 - 2)中，加入到含有饲养细胞 的96孔板内.根据情况每2~3 d换液一次。换液时吸去l/2~2/3培养液，加入等量的新鲜 培养液。在融合后7 d内用HAT培养液，杀死瘤瘤融合细胞后，第七天至第十四天改用HT 培养液，第十四天以后用普通的RPMl1640完全培养液(表4 - 3)，从融合后8~9d就可对所 有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测，筛选出产生抗体的阳性克隆。;由于在最适宜的培养 条件下，大约有105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在日AT培养液中相继死 亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活，所以通常要加入饲养细胞才能使其