实时荧光定量PCR技术-全面分析重点.ppt

RNA标准曲线 精密度差 精密度高 精密度低 40次相同的重复 3次相同的重复 精密度低的原因 加样误差 操作、移液器、反应液未混匀 体系配置方法 低拷贝数的样品（泊松分布） 没有使用ROX校准 扩增曲线异常—平台期低 样品浓度？ 引物二聚体或浓度？ 扩增曲线异常—指数增长期异常 无指数增长期或指数增长期较短 扩增曲线异常—曲线不光滑 扩增时间开始较晚，定量不准确 标准曲线评价 评价标准曲线： 扩增效率(E) ---90%-110% 相关系数(R2) ---大于0.99 平行管重复性 ---SD小于0.167 标准曲线差 可能的影响因素 稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解 定量PCR的新运用 等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析 * * 常规PCR重要的是终产物的定性分析，虽然有些能够根据中产物半定量，但是不够精确；实时荧光定量PCR则是伴随PCR反应监测每一个循环的产物量变化，通过对数据的分析达到队初始模板进行精确的定量。 * 介绍图 说明指数扩增的重要性 * 人为规定的阈值，去哪一点计算？消除背景干扰，在指数扩增期内， 是为了引入C(t)值概念 * 并不能解决问题。 1.Xn是荧光值 2.未知数太多 3.Ct重现性 * SYBR Green I法进行相对定量的问题 问题： SYBR Green I可以与非特异性双链结合 非特异产物信号 结果不准确 解决办法： 引入熔链曲线分析 熔链曲线分析 在PCR反应程序结束后，逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线 温度 荧光信号强度 Tm Tm值：DNA解链一半时的温度 -dI dT Tm 熔链曲线分析 决定退火温度 Non-specific product specific product specific product 实时定量PCR两种相对定量方法比较 相对双标准曲线法和2-ΔΔc(t) 法 相对标准曲线法 用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线 处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值 用内标基因对目标基因均一化 处理样本与未处理样本目标基因C(t)值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异 适用范围 目标基因与内标基因扩增效率差异较大 扩增效率较低 2-ΔΔc(t) 法 公式推导 M:目标基因，N：内标基因 XC(t)M=X0M*2C(t)M=A(域值) (1) XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域值) (2) 均一化 (1)/(2): X0M/X0N=2 C(t)N- C(t)M=2-ΔC(t) 处理2与处理1相比：? (X0M2/X0N2): (X0M/X0N)= 2-ΔC(t)2-ΔC(t)1=2-ΔΔC(t) ΔΔC(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1) 当有多个样品时（如时间点），各样品均一化后都与同一时间点相比 一般步骤 选定目标基因和内标基因 设计一步法或两步法RT-PCR反应 数据获得及处理 目标基因C(t)值（处理，未处理） 内标基因C(t)值（处理，未处理） 计算2-ΔΔc(t) 作图 适用范围 当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比较一致★ 不做标准曲线，高通量检测 目标基因和内标基因扩增效率的快速检测 通过并列跑两条扩增曲线，查看指数增长期的曲线之间是否平行 验证试验 目的基因和内参基因扩增效率一致性检测 检测目标基因与内标基因在不同稀释浓度下的ΔC(t)，以稀释倍数与ΔC(t)作图，当直线的斜率近似于0（绝对值要小于0.1）时，说明目标基因与内标基因扩增效率一致。 问题与解决 为保证扩增效率一致 扩增子长度 引物设计 模板纯度、复杂度等 反应条件 定量PCR实验实例分析 利用TaqMan法研究ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异（相对标准曲线法） 已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准 选用GAPDH作为内标基因 FAM标记的ERBB2探针 VIC标记的GAPDH探针 构建标准曲线 双重PCR反应 阴性对照 无RNA对照