实时荧光定量PCR简介及其在食品监测领域中的应用重点.doc

实时荧光定量PCR简介及其在食品检测领域中应用 摘要：实时荧光定量PCR 是在定性PCR 技术基础上发展起来的核酸定量技术；该技术不仅实 现对DNA 模板定量，且具有灵敏度高、特异性强、无污染性、及实时性和准确性等特点。该文主要介绍实时荧光定量PCR 原理和在食品检测中应用，及其在食品领域发展前景。 关键字：荧光定量PCR；致病菌检测；转基因食品检测 Abstract：Real–time fluorogenic quantitative polymerase Chain Reaction is a quantitative nucleic acids technology based on quanlity PCR，with characteristics of high sensitivity and specificity，pollution–free，instantaneity and accuracy as well as realization for quantitation of DNA template. its principle and application in food detection have been introduced in this article，and its prospect in food field predicted. Key word：real–time quantitative PCR；pathogen detection；genetically modified food detection  实时荧光定量PCR技术原理 实时定量荧光PCR技术是从传统 PCR技术发展而来，其基本原理是相同的，主要不同之处是其定量的体系。PCR反应过程产生DNA拷贝数，随反应循环数增加，以呈指数方式增加逐渐转入平台期。在传统PCR中，用终点法对PCR产物定量有不足之处；而在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，加入的荧光物质具有特定的波长，随着PCR反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始 DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。 为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT（threshold value）值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。[1~2] 实时荧光定量PCR 类型 实时荧光定量PCR 类型主要有探针类和非探针类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交探针指示扩增产物增加，特异性高；而非探针类是即实时定量荧光PCR技术最后是通过标准曲线对未知模版进行定量分析的方法。利用染料或特殊设计引物指示扩增增加，特异性受到质疑，但其简便易行。近年来，又发展一些新的预防或识别非特异扩增的探针法，例如Amplisensor 技术、分子信标（Molecular beacon）、Lightcycler 技术、复合探针法（Complex probes）等。 实时荧光定量PCR 类型探针类 按其基团标记和能量转移的方式，目前已经开发出几种相关的技术，大体可以分为水解探针和杂交探针两类。TaqMan TM探针(水解探针)、TaqMan MGB (水解探针)、Dual-oligo FRET pairs(双杂交探针)、MolecularBeacons (杂交探针)、ScorpionsTM/AmplifluorTM (杂交探针)、Universal probe library-LNA ( locked nucleic acids水解探针)、LUX (杂交探针)