实验9.3RedET同源重组2015.3.25重点.ppt

1. 重组质粒的构建 (1) 传统基因克隆技术的缺点 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切 酶的消化，当缺少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时，利用内切酶消化难以得到相应的产物。 方法看似简单，但实验周期长。 大片段难以与载体正确连接。 无法同时连接多个（2个以上）的DNA片段。 限制性内切酶 连接酶 步骤1： 酶切目的片段 步骤2：酶切载体 步骤3: 目的片段与载体连接 同源重组克隆步骤 传统克隆步骤 步骤4: 重组子转化到感受态细胞 同源重组克隆 传统克隆 克隆片段长度 50bp-10kb 50bp-2kb 一次克隆片段数 1-5个 1个 感受态效率要求 1×108cfu/ug以上 1×107cfu/ug以上 所用的酶 重组酶 T4连接酶 片段的插入位点 任何位点 特定位点 片段酶切 不需要 需要 载体线性化方法 酶切或PCR 酶切 同源重组克隆与传统克隆比较 插入选择标记 插入无选择标记的DNA片段 2. 染色体的修饰 E. coli染色体上插入抗性基因 传统基因工程技术（A）和Red/ET重组技术（B）修饰E.coli染色体实验步骤比较 （B） 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小 3. 亚克隆 （Subcloning） 4. 直接克隆 （Direct cloning） （A）亚克隆和直接克隆示意图 Red/ET subcloning 亚克隆 pGB-15A载体抗性基因簇 直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇 3 mg基因组DNA用EcoR V消化 Mx unknown PKS gene cluster (~36kb) p15A ori Cm PKS from other bacteria： Photorhabdus lumineciens Psedumonas flurescencse 异源表达 七、 Red/ET重组新技术的发展 1. 三重同源重组（Triple recombineering） 三重同源重组示意图 cry1Ac的启动子片段和终止子片段“一步”重组入pHT315质粒上 2. 四重同源重组（Quadruple recombineering） 四重同源重组示意图 质粒pR6K-GT1-cotc-lacZneo上目的片段（6123bp）插入人类scn10a基因BAC的第一个内含子中 3. “双同源臂”策略(Double homology arms strategy) “双同源臂”策略示意图 * 重组DNA技术对于研究－－基因结构和功能、基因表达和调控、人类对各种疾病（遗传病）的基因治疗. Red/ET同源重组技术 2015年3月25日 内 容 一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用 遗 传 重 组 基因组的可变性和稳定性之间必须维持一个恰到好处的平衡，这样才能使生物体得以生存并能世代相传，繁衍不息。 染色体的遗传差异主要由两种 机制产生，一种是突变，一种是遗传重组。 ? 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子） ? 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ? 遗传重组与重组DNA技术 异常 广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程 一、 什么是Red/ET同源重组 1. 概念 Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组酶Redα/Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同源重组的DNA工程技术。 2. 原理 首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体和插入片段的黏性末端（15-50bp） 互补形成稳定的带缺刻的环状重组质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒 3. 特点： Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作简单、快速的特点。 4. 应用 这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。 g b a l phage ET Rac phage Rac re