实验五质粒DNA酶切(质粒限制性内切酶消化酶切)重点.ppt

质粒DNA酶切（质粒限制性内切酶消化酶切） 背景知识 一、质粒图谱的阅读 二、限制性内切酶 一、质粒图谱的阅读 　　第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 tetr 可以阻止四环素进入细胞。 camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活 hygr 使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。 一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即：启动子——核糖体结合位点——克隆位点——转录终止信号。 这是用来区别克隆载体与表达载体的。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。 二、限制性内切酶 1) 概念 　　　限制性核酸内切酶(restriction ednonuclease)是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的内切核酸酶（endonuclease)的总称。 至2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种，商品化的609种，II型中共有223种特异性。 2) 命名原则 1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类 ① 限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus)；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。 ② 第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。 ③ 若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。 3) 类型 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。 4) 基本特性及用途 Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有180°的旋转对称性即迴文结构。Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。 5′粘性末端 3种切口 3′粘性末端 平头末端 5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素 ① DNA样品纯度 ② DNA样品甲基化程度 ③ 酶的星活性 (star activity) ① DNA样品纯度 A）样品杂有RNA 虽不影响酶反应速度，但RNA很易与酶蛋白发生非特异性结合而减少酶有效浓度，使酶解不彻底；另外，干扰DNA片段电泳观察。 B）少量的蛋白质污染 对酶解影响不大，但若有核酸酶等蛋白质污染时，会干扰酶切反应，并影响酶解产物。 C）样品中杂有其他DNA 如质粒DNA中杂有染色体DNA，虽不影响酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。 D）其他杂质 如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，会影响酶切速度，甚至改变酶的识别特异性，出现酶的第二活性。 ② DNA样品甲基化程度 限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应，则该DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一， DNA甲基化现象广泛的存在于原核和真核生物中。 如： ③ 酶的星活性 (star activity) 实验目的 １）了解酶切原理，掌握酶切体系建立原则 ２）用EcoR Ⅴ 切割质粒pCAMBIA1302 3）用EcoR Ⅴ切割银杏基因组DNA 实验原理 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。 限制性内切酶EcoR Ⅴ 特异性识别位点为：　　 实验材料和试剂 实验材料：质粒pCAMBIA1302