实验细菌的革兰氏染色重点.ppt

实验三 细菌细胞的简单染色和革兰氏染色 （Gram stain） 一、实验目的 了解革兰氏染色的原理； 学习并掌握革兰氏染色的方法。 巩固显微技术和无菌操作技术 二、基本原理 所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。 它是1884年由丹麦医师Gram创立的。 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。 碱性染料初染液——结晶紫（crystal violet） 媒染剂——碘（iodine） 脱色剂——95％的酒精（ethanol） 复染液——番红 三、实验器材 1、菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌,未知菌； 2、试剂：草酸铵结晶紫，番红水溶液，碘液，95%乙醇， 3、仪器：显微镜，载玻片等。 四、实验步骤 （一）细菌细胞的简单染色 1、涂片 ：取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作挑取大肠杆菌和枯草芽孢杆菌于载玻片的水滴中，调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。 2、干燥 ： 室温中自然干燥。 3、固定： 涂片面向上，于火焰上通过2—3次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。 4、染色：放标本于水平位置，分别滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。结晶紫染色液染2—3分钟，石炭酸复红染色液约染1—2分钟。 5、水洗： 染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油镜下观察。 6、镜检 （1）、低倍镜观察 （2）、高倍镜观察 （3）、油镜观察 7、观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。 2．染色 （1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 （2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 （3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。 （4）复染用番红液染1～2分钟，水洗。 （5）镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 1．结果 在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？未知菌染色后是什么菌？ 2．思考题 （1）P84:(1) （2）P84:(2) （3）P84:(5) 下次实验：细菌细胞的芽孢和鞭毛染色 * * * * 革兰氏染色的原理 A. 加小滴水? B. 涂成薄层 C. 固定菌体 涂片制备过程 （二）细菌细胞的革兰氏染色 1．涂片：将培养24小时的枯草芽孢杆球菌、大肠杆菌和未知菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 五、实验报告 大肠杆菌（G-） 革兰阳性 革兰阴性 枯草芽孢杆菌（G+） * *