生物分子的分离纯化重点.ppt

（1）分离纯化方法千差万别，没有一种标准方法可通用于各种生物大分子的分离制备； （2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中各种组份的综合影响 生物大分子制备的一般步骤： 制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间理化性质的差异。 核酸的浓缩、沉淀与洗涤 随着提取试剂的逐步加入，去除杂质时的丢失，样品中核酸的浓度会逐步下降，当不能满足后续研究与诊断所需时应对样品进行浓缩。 沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法， 优点： ①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。 核酸的鉴定与保存 （一）核酸的鉴定 1. 浓度鉴定 核酸浓度的测定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。 ⑴ 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm，这一物理特性。 ⒉ 纯度鉴定 紫外分光光度法或荧光光度法皆可用于核酸制品的纯度鉴定。 ⑴　紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。 ⑵　荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA大得多，电泳迁移率低。 ⒊　完整性鉴定 ⑴　琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状。完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值，如有改变则提示有RNA的降解。此外，若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。 ⑵　其它方法：必要时，还可通过一些特殊的实验来鉴定RNA的完整性。 如小规模的cDNA第一条链的合成反应，已知大小的某种mRNA的Northern杂交等 (1) 对DNA ① DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存；在-70℃可保存数年 ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。 (2) 对RNA ① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 ℃保存; ② 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ③ 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。 1、酚抽提法(SDS法） 2、 甲酰胺解聚法 3、玻棒缠绕法 基因组DNA－其它方法 　物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 　化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 　生物方式：酶法 基因组DNA－其它方法 　吸附材料结合法： 基因组DNA－其它方法 　浓盐法： 　　　　 　有机溶剂抽提法： 　　　　 　密度梯度离心法： 　　　　　　　 基因组DNA片段的纯化 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段 1、碱裂解法 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－碱裂解法 2、SDS裂解法 SDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA 由于条件温和，该法特别适用于大质粒DNA（15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。 3、煮沸裂解法 质粒DNA的纯化 1、CsCl-EB法 利用CsCl形成的连续密度梯度，在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。 2、聚乙二醇沉淀法 （一种分级沉淀法） 3、柱层析法 （树脂） RNA极易被RNase水解，除胞内的RNase外，它还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中；RNase分子结构中二硫键的存在使其生物学活性非常稳定，加热煮沸及一般的变性剂均不能使其完全灭活，而且去除变性剂（denaturant）后，RNase的活性又可恢复。 因此，在RNA的制备过程中，排除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键 为获得完整的RNA分子，必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。 选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）。 蛋白酶K和能与蛋白质结合的阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠，并联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。 此外，在变性液中加入β-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。 由Chomczynski和Sacchi 于