实验一动物肝脏组织中基因组DNA提取和鉴定重点.ppt

实验一 动物肝脏组织基因组DNA的提取（高盐法） * * 核酸的分类 DNA (脱氧核糖核酸) 主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。 RNA（核糖核酸） 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。 核酸的理化性质 在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在。 溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。 在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来。 浓盐法：利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度不同将二者分离。 离子去污剂法：利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）等去污剂使蛋白质变性，直接从生物材料中提取DNA。 苯酚抽提法：苯酚既是蛋白变性剂，又能抑制DNase的降解。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA连接键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 基因组DNA的提取方法 核酸提取的主要步骤 破碎细胞：研磨、组织匀浆、超声、冻融；异硫氰酸胍、碱裂解；酶解（溶菌酶） 除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子：酚/氯仿抽提、蛋白变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）、蛋白酶处理、高盐洗涤 除去其它不需要的核酸分子 沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质 注意事项 避免过酸、过碱及高温 加入DNA酶抑制剂：柠檬酸、氰化物、砷酸盐、EDTA、SDS、苯酚等 蛋白变性剂反应不宜过于剧烈 加入RNA降解酶除RNA 学习并掌握用高盐法从动物肝脏组织中的提取基因组DNA方法及其原理。 一、实验目的 二、实验原理 核酸在真核细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，用DNP和RNP表示。 DNA-Pro（DNP） (存在于细胞核) RNA-Pro(RNP) (存在于核仁及细胞质) 溶于高盐溶液（1mol/L）, 微溶于低盐溶液（0.14mol/L） 溶于低盐溶液（0.14mol/L） 微溶于高盐溶液（1mol/L） 三、仪器和试剂 1、仪器： 低速离心机、落地式高速冷冻离心机、摇床、稳压电源、电泳槽、凝胶成像系统。 2、试剂： 0.14mol/L NaCl－0.15mol/L EDTA(pH=8.0)；2.5mol/L NaCl；25% SDS；氯仿/异戊醇=24:1（V/V）；95%乙醇；1×TAE；琼脂糖；上样缓冲液。 四、实验步骤 1、DNA的提取 （1）称取5g鸡肝，置于预冷的研钵中，在冰浴中剪碎，加入10mL预冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，研磨成匀浆液。 （2）将匀浆液加入到15mL刻度离心管中，2000r/min离心10min，弃去上清液。 （3）将沉淀转移至50mL离心管中，加入10mL预冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，充分摇匀后，于4℃ 2000r/min离心10min，弃去上清液。 四、实验步骤 1、DNA的提取 （4）将上述沉淀转移至100mL锥形瓶中，加入10mL预冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，缓慢搅拌，同时加入750uL 25%SDS溶液，用封口膜封口，置于摇床中，30℃ 150r/min震荡30min。 （5）加入7mL 2.5mol/L NaCl，用封口膜封口，置于摇床中，30℃ 150r/min震荡10min。 。 （6）再加入17mL 氯仿:异戊醇溶液，用封口膜封口，置于摇床中，30℃ 150r/min震荡20min。 。 四、实验步骤 1、DNA的提取 （7）将混合液转移至50mL刻度离心管中， 3500r/min离心10min ，取上清至一个新的50mL刻度离心管。 （8）加入20mL95%乙醇溶液，上下颠倒混匀后，出现丝状物，用枪头挑取丝状物，或者3500r/min离心5min 。 （9）弃去上清液（注意：缓慢倒去上清液），沉淀物质即为DNA，空气干燥后即可加入适量的TE缓冲液。 * * *