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实验一 动物肝脏组织基因组DNA的提取(高盐法) * * 核酸的分类 DNA (脱氧核糖核酸) 主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA,如线粒体DNA(mtDNA),叶绿体DNA(cpDNA),质粒DNA。 RNA(核糖核酸) 存在于细胞质中,如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA,RNA外,还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体,其或只含DNA,或只含有RNA。 核酸的理化性质 在细胞内通常与蛋白质结合,以复合物形式存在。 溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。 在酸性溶液中容易降解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。 在强大离心力的作用下,可以从溶液中沉降下来。 浓盐法:利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度不同将二者分离。 离子去污剂法:利用SDS、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)等去污剂使蛋白质变性,直接从生物材料中提取DNA。 苯酚抽提法:苯酚既是蛋白变性剂,又能抑制DNase的降解。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA连接键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。 基因组DNA的提取方法 核酸提取的主要步骤 破碎细胞:研磨、组织匀浆、超声、冻融;异硫氰酸胍、碱裂解;酶解(溶菌酶) 除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子:酚/氯仿抽提、蛋白变性剂(SDS、异硫氰酸胍等)、蛋白酶处理、高盐洗涤 除去其它不需要的核酸分子 沉淀核酸,去除盐类,有机溶剂等杂质 注意事项 避免过酸、过碱及高温 加入DNA酶抑制剂:柠檬酸、氰化物、砷酸盐、EDTA、SDS、苯酚等 蛋白变性剂反应不宜过于剧烈 加入RNA降解酶除RNA 学习并掌握用高盐法从动物肝脏组织中的提取基因组DNA方法及其原理。 一、实验目的 二、实验原理 核酸在真核细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在,用DNP和RNP表示。 DNA-Pro(DNP) (存在于细胞核) RNA-Pro(RNP) (存在于核仁及细胞质) 溶于高盐溶液(1mol/L), 微溶于低盐溶液(0.14mol/L) 溶于低盐溶液(0.14mol/L) 微溶于高盐溶液(1mol/L) 三、仪器和试剂 1、仪器: 低速离心机、落地式高速冷冻离心机、摇床、稳压电源、电泳槽、凝胶成像系统。 2、试剂: 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA(pH=8.0);2.5mol/L NaCl;25% SDS;氯仿/异戊醇=24:1(V/V);95%乙醇;1×TAE;琼脂糖;上样缓冲液。 四、实验步骤 1、DNA的提取 (1)称取5g鸡肝,置于预冷的研钵中,在冰浴中剪碎,加入10mL预冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液,研磨成匀浆液。 (2)将匀浆液加入到15mL刻度离心管中,2000r/min离心10min,弃去上清液。 (3)将沉淀转移至50mL离心管中,加入10mL预冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液,充分摇匀后,于4℃ 2000r/min离心10min,弃去上清液。 四、实验步骤 1、DNA的提取 (4)将上述沉淀转移至100mL锥形瓶中,加入10mL预冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液,缓慢搅拌,同时加入750uL 25%SDS溶液,用封口膜封口,置于摇床中,30℃ 150r/min震荡30min。 (5)加入7mL 2.5mol/L NaCl,用封口膜封口,置于摇床中,30℃ 150r/min震荡10min。 。 (6)再加入17mL 氯仿:异戊醇溶液,用封口膜封口,置于摇床中,30℃ 150r/min震荡20min。 。 四、实验步骤 1、DNA的提取 (7)将混合液转移至50mL刻度离心管中, 3500r/min离心10min ,取上清至一个新的50mL刻度离心管。 (8)加入20mL95%乙醇溶液,上下颠倒混匀后,出现丝状物,用枪头挑取丝状物,或者3500r/min离心5min 。 (9)弃去上清液(注意:缓慢倒去上清液),沉淀物质即为DNA,空气干燥后即可加入适量的TE缓冲液。 * * *
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