实验一感受态制备及转化重点.ppt

一、实验目的 学习大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及转化子鉴定的基本原理和操作技术。 二、实验原理 感受态细胞(Competent Cells)：受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许外源DNA分子进入。 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 目前常用的转化方法为电转化法和化学转化法，电转化法简便易行，转化效率高，但需要专门的电转化仪；化学转化不需要额外的设备，成本较低。 致敏过程：用理化方法诱导细胞进入感受态的操作； 细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物； 复苏：细菌在非选择性培养基上保温一段时间，使抗性的表型表达后再转到含抗性的选择性培养基上，长出来的菌落即为转入了外源基因的菌落； Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力 影响转化效率的因素 细菌的生长状态(5x107个/mL) 感受态细胞的质量 试剂的质量 外源DNA的质量与数量 器皿的洁净度 污染—尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行 三、器材与试剂 1.材料 大肠杆菌菌株Top10、重组质粒。 2.设备 恒温摇床、电热恒温培养箱、台式高速离心机、超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、分光光度计、微量移液枪、1.5mL离心管。 3.试剂 LB液体培养基、氨苄青霉素母液(Ampicillin, Amp)、含Amp的LB固体培养基、0.1mol/L CaCl2灭菌溶液，IPTG, x-gal。 四、实 验 流 程 （一）感受态细胞的制备： 1. 预培养：接一单菌落到3mL LB培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜； 2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含40mL LB液体培养基的锥形瓶中， 370C、250rpm振荡培养2.5～3小时（OD600 0.4～0.5）； 3. 将菌液转移到1.5mL离心管中，冰上放置10min； 4. 离心 5000rpm，40C，5min； 5. 倒出培养液，将管倒置，使培养液流尽； 6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 1.0mL，轻吹并悬浮细胞，冰上10min； 7. 离心 5000rpm ，40C，5min，去上清； 8. 用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2 100μL用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作； 9.此为感受态细胞，若储存则需加入15～30%甘油，可在-700C或-200C冻存。 （二）转化及复苏： 1. 取 100 μL感受态细胞，加入重组DNA 20 μL （50ng)； 取 100 μL感受态细胞，加入20 μL无菌水（阴性对照1）； 取 100 μL感受态细胞,加入对照DNA 20 μL （阴性对照2） 用枪头混匀，冰上放置20min。 阴性对照的目的？ 2. 420C循环水浴热激90秒 3. 冰浴2分钟 4. 每管加800μL LB液体培养基，370C慢摇40min（120～140rpm） 5. 40C，5000rpm离心2min，弃去600μL，取20～50μL菌液，加40μL X-gal和4μL IPTG，混匀后涂布在含Amp的培养皿中 6. 倒置培养过夜（ 370C） 注意事项 1. 无菌操作 2. 低温操作（冰上操作） 3. 动作要轻柔 思考题 1.如果阴性对照中长出菌落，可能的原因是什么？ 2.在Amp+培养板中，菌的密度过高或培养时间过长时会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是Amps的，是什么原因导致这些卫星菌落产生的？