实验一融合蛋白表达载体构建的设计与质粒提取与分析重点.ppt

实验报告 题目：质粒DNA的提取及检测 结果：质粒浓度及电泳图谱 分析：分析提取的质粒DNA的质量、浓度及其原因。 思考题 什么是DNA重组技术？其实验的主要目的是什么？ 设计构建融合蛋白表达载体时，最应注意什么问题？ 如何正确使用微量移液器？使用中应特别注意那些事项？ 在大肠杆菌培养过程中应注意哪些问题？ 当用平板培养时，为什么培养皿必须倒置？ 碱裂解法提取质粒DNA时应注意哪些问题？溶液I、II、III的作用分别是什么？ 什么的苯酚不能用？如何保持苯酚？ * * * * * * * * * * * * * * * * 原核表达系统中的各因素 复制子 ：通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关 筛选标记和报告基因 ：氨苄青霉素 ，卡那霉素 启动子 ：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一 组成型表达 :组成型启动子 诱导调控型表达 :IPTG 融合表达 ：GST, His-Taq 分泌表达 :信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜 可溶性表达 : 转录终止子 :控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降 核糖体结合位点 :多数载体启动子下游都有SD序列 表达菌株 :不同的表达载体对应有不同的表达菌株 对原核表达载体应该注意3点： ① 选择合适的启动子及相应的受体菌； ② 用于表达真核蛋白质时注意阅读框错位； ③ 根据表达天然蛋白质或融合蛋白来选择相应的表达载体。 GST克隆载体的选择与构建 昆虫谷胱氨肽-S-转移酶基因 pPRO EX-HT载体 体外表达GST蛋白 GGCACGAGGCAACAAAATGGCCAAGAAACTACATTATTTCCATTTGAACGGGCTTGCTGAGTCCATCAGGTACATCCTGCACTACGGCGGACAAAAGTTCGAGGATGTCAGATACGATCTGAAAAGCTGGCCCATCAAGAGTGTGAAAGACACTCTCCCATACGGCCAGCTGCCACTCTACGAGGAGGGAAATAAGACCCTAAACCAGTCACTGGCCATCGCGCGCTACGTAGCTGCCCAGGTCCACCTCCTGCCCACCGATCCCTGGGAGCAGGCCGTCCTGGATGCCATCGTCTTCAACATCTATGACTTCTGGGGAAAGATTCTGGTCTTCATCAAGGAGAATGATGCTGCTAAGAAGGAGGTAATCAAGAAGGAGATCATAAACGAATCCGTTGACTTCTTCTTCTCCCGATTTGAGAAGGAACTTAAGGCCAACAAGGGATTCTTCAACGGAAAGCTGAGCTGGGCTGACTTCGTCCTTGTGGGCATCGTCGAGTCTGCAAACCTGTNCCTTGGCACCGAGATTGAGAAGAAATACCCCACCGTGCTCGTGCTCGTCCAGAAAATCGCACCCTCCCTGGAGTGAAGGANTCATCGCGACTAGGAAACCATATGCTCTATAAATAAAGTACACGTACTGTAAAAAAAAAAAAAA Primers： GGCACGAGGCAACAAAATGG CGTGTACTTTATTTATAGAGCATATGG GST nucleotide sequence and open reading frame (yellow) pPROEX HT蛋白表达载体 GST in pGEM-easy vectorGGA ATT CGA TTG GCA CGA GGC AAC AAA ATG … … EcoR I GST体外蛋白表达的实验流程 第二部分：质粒DNA的提取 Part I： 质粒DNA提取的原理 什么是质粒（plasmid）？ 质粒是染色体外的稳定遗传因子 大小1-200Kb 双链、闭环、超螺旋DNA 主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中 自主复制和转录，并表达所携带的遗传信息。 碱裂解法抽提质粒DNA 基本原理 质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，