实验一特殊显微镜及其使用重点.ppt

阻断滤光镜(barrier filter)： 位于物镜之上，二向色镜与目镜之间，用以阻断或吸收没有被标本吸收的激发光，以防伤害眼睛，使荧光透过。在荧光中也仅有部分波长被选择透过。 选用的原则，以能完全阻断或吸收波长长于所需荧光的光线，并透过样品发出的荧光。 2.4、荧光显微镜的光路 因荧光激发的方式不同，分为： 透射荧光显微术光路 反射荧光显微术光路 透射荧光显微镜光路图 反射荧光显微镜光路图 汞灯 激发滤镜 集光镜 目镜 阻断滤镜 二向色镜 物镜 样品 3、荧光显微镜的分类： 3.1.透射荧光显微镜： 光源：高压汞灯或卤素灯。 聚光镜：使用暗场聚光镜，使激发光和荧光分离出来。 物镜：可用任何种类的物镜。 标本：因为是透射观察，薄的标本比较适合。 缺点： 必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不能获得明亮的荧光像。 由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚的载玻片。 视场照明区不能过大，否则容易使荧光标本荧光色衰褪。 厚的或不透明的标本不适用。 优点： 由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差。 由于上述同样的原因，任何物镜都可用于观察。 用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。 3.2.反射荧光显微镜： 光源：高压汞灯或卤素灯。 聚光镜：因为物镜作为聚光镜，所以不需要聚光镜。 物镜：所用的物镜必须能透过足够的紫外光，而且本身不产生荧光，对数值孔径没有限制。 标本：厚的标本或不透明的标本都能观察。 优点： 由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。 采用柯拉照明法，可利用孔径光阑和视场光阑的效果。 物镜数值孔径不受限制，在高放大被率时，也可以获得高分辨率的像。 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透射微分干涉差法相结合。 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。 1）打开灯源开关（汞灯及普通灯光源），超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。 2）反射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。 3）放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤； 4）高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。 5）先在普通光源下（数字调为1）用10倍物镜调整好玻片的焦距，后转至40倍物镜。材料目标与焦距调好后，关闭普通光源的电源（或用载物台下面的挡板将来自下面的普通光源挡住），数字调至2-4，其中2为红色激发光，3为蓝色激发光，4为绿色激发光，蓝色激发光波长最短，一般应用蓝色3，即可看到荧光照片。 荧光显微镜主机的上部分右侧分别有调整荧光光圈、光强的拉杆及照相拉杆。 4、使用方法（反射荧光显微镜） 5、用途 1)观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构 2)标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。 3)细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。 4)荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布。 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 内容：荧光显微镜下观察单细胞藻类 材料：小新月菱形藻 仪器：载玻片、盖玻片、荧光显微镜 6、 实验内容、材料与仪器 1、FCM的结构可分为5部分： ①流动室及液流驱动系统； ②激光光源及光速形成系统； ③光学系统； ④信号检测与存储、显示、分析系统； ⑤细胞分选系统。 2、FCM的工作原理： 1） 将待测细胞染色后，制成单细胞悬液。用一定压力 将待测样品压人流动室，同时，不含细胞的磷酸缓冲液 在高压下从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流 成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动， 组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行 排列，依次通过检测区域。 四、流式细胞仪(flow cytometer, FCM) 2） 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后 的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在 激光束的照射下，产生散射光信号和荧光信号。 散射光信号分为前向角散射光信号(FSC)和与激光束 成90°收集的侧向角散射光信号(SSC)。 FSC基本上反映细胞体积的大小，通常在FCM检测作 为阈值来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒； SSC主要反映细胞的颗粒特性