实验一质粒DNA的提取和鉴定重点.ppt

分子生物学 从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。 移液器和EP管 琼脂糖凝胶 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。 凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝胶层析和电泳。 电泳鉴定 其中超螺旋结构泳动最快； 其次为线性结构； 最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起）； 染料——EB 溴化乙锭（EB）是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光。 注意 EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必须进行清洗或弃去。 细菌培养与质粒扩增 1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活化菌种），37℃过夜培养 2. 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体培养液内（含氨苄青霉素），37℃振荡过夜培养 3. 从中取4毫升种子菌液于含M9培养基中（含Ap），37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0） * * 毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术。实际上包含色谱、电泳及其交叉内容，其分离机制是靠色谱与电场两种作用，依据样品组分的分配系数及电泳的迁移率差别而分离。 质粒DNA的提取和纯化 生化与分子生物学系 基因工程 质 粒 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧核糖核酸物质。 质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。 分类： 单拷贝质粒； 多拷贝质粒； 紧密控制型； 松弛控制型； 质粒DNA的提取方法 碱裂解法； 煮沸裂解法； 酚氯仿抽提法； 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理。 基本思路 培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需) 电泳检测； 碱裂解法的基本原理 十二烷基磺酸钠(SDS) 可使细胞膜裂解。 经SDS处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。 当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circularDNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开。 当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。 实验步骤 1、将含有质粒的DNA细菌在LB培养基中培养过夜。取1.5ml LB培养液倒入1.5mleppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡）。 4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴2分钟。 5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。 6、上清液（450uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积的饱和酚（1:1），充分颠倒混匀，4℃下12000g离心10分钟。 7、将水相（400uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积酚/氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心10min。 8、将水相（350uL）移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。 8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入0.5ml 70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。 9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟